CTX-M型雜合酶生化特性及遺傳特征研究.pdf

1、近年來，CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）的出現給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)，三種CTX-M雜合酶（CTX-M-64、-123和-132）已經在我國動物源大腸桿菌中檢測到，它們對大多數頭孢菌素類表現出增強的水解活性，其基因序列暗示了這些雜合基因可能是通過blaCTX-M-14和blaCTX-M-15的重組形成。本文旨在比較雜合酶及其母體酶的動力學參數，結合蛋白空間結構分析其催化作用機制，并探索雜合基因的可能形成途徑，為CTX-M

2、酶的進一步研究提供科學依據及參考數據。
　　本研究通過PCR方法擴增出雜合酶（CTX-M-132、-123和-64）及其母體酶（CTX-M-55、-15和-14）的編碼基因完整序列（876 bp）及不含信號肽的序列，并將其插入pET-28b表達載體。重組質粒轉入E.coli BL21（DE3），分別用于MIC值的測定及蛋白表達。在蛋白表達水平一致的情況下，測定攜帶blaCTX-Ms全長的六株重組菌對各種β-內酰胺類抗生素的MIC值

3、。結果顯示，產CTX-M-14的菌株對除了氨芐西林外的所有受試抗生素的MIC值最低，產CTX-M-64、CTX-M-132、CTX-M-123和CTX-M-55的菌株對頭孢噻肟和頭孢他啶的MIC值高于CTX-M-15，其中CTX-M-64對頭孢噻肟的MIC值最高。整體來看，六種blaCTX-Ms基因的耐藥性水平從低到高的順序為：blaCTX-M-14、blaCTX-M-15、blaCTX-M-55、blaCTX-M-132、blaCTX

4、-M-123和 blaCTX-M-64。β-內酰胺類抑制劑（克拉維酸、他唑巴坦和舒巴坦）對六種酶都有較好的抑制作用，其中克拉維酸和他唑巴坦的抑制作用較強，與頭孢噻肟聯用后的MIC比單獨使用頭孢噻肟時減小高達近70000倍。
　　SDS-PAGE結果顯示，六個目的蛋白的大小均約為28 kDa，最佳表達條件是IPTG1.0 mmol/L，30℃誘導培養(yǎng)5 h。通過親和層析和凝膠過濾層析方法得到純度大于99％的目的蛋白，用于酶動力學參數

5、的測定。結果顯示，這些酶的催化活性（kcat/Km）與MIC結果相似，CTX-M-14對除了頭孢噻吩外的所有β-內酰胺類抗生素的催化活性最低，而CTX-M-64對頭孢硝基噻吩、頭孢呋辛、頭孢噻呋、頭孢曲松和頭孢噻肟的催化活性最高。CTX-M-15對除了氨芐西林外的β-內酰胺類抗生素的催化活性均低于CTX-M-55及三個雜合酶CTX-M-64、-132和-123的催化活性。另外，三種抑制劑對六種CTX-Ms酶的抑制水平均在納摩級，其中舒巴

6、坦的IC50和Ki值高于克拉維酸，而克拉維酸略高于他唑巴坦。
　　結合酶動力學參數，對六種CTX-Ms酶的氨基酸序列及空間結構進行比較分析。結果發(fā)現，CTX-M-55與CTX-M-15相差僅一個氨基酸殘基A77V，但CTX-M-55對超廣譜頭孢菌素類藥物表現出相對較強的催化活性。結構分析顯示，第77位氨基酸位于活性位點遠端，CTX-M-55更可能是通過V77與不同α螺旋上的關鍵氨基酸形成疏水鍵，從而穩(wěn)定蛋白空間結構中螺旋群的核心架

7、構并促成更加穩(wěn)定的活性部位構象。穩(wěn)定構象的形成促成了CTX-M-55的較高結構穩(wěn)定性，進而表現出了較高的催化效率和對溫度變化的耐受性。從CTX-M-15、CTX-M-132、CTX-M-123到CTX-M-64的演變是通過向CTX-M-15中逐漸引入活性中心遠端殘基的過程，并且在演變過程中它們對超廣譜頭孢菌素類藥物的催化活性也在逐漸增強。與CTX-M-14相比，CTX-M-64對頭孢菌素類增強的催化活性及對β-內酰胺酶抑制劑增強的敏感性

8、大部分也是由于活性中心遠端殘基的引入。這些結果表明，活性中心遠端的氨基酸殘基增強了CTX-M酶對超廣譜頭孢菌素類藥物的催化活性。
　　通過PCR測序的方法，對實驗室保存的分離自2010~2013年的大腸桿菌檢測blaCTX-M雜合體基因，并對陽性大腸桿菌進行多位點序列分型。通過接合轉移或化學轉化的方法獲得攜帶雜合酶基因和其可能來源基因blaCTX-M-15和blaCTX-M-55單一質粒的接合子或轉化子，S1-PFGE鑒定質粒大小

9、，并對質粒進行復制子分型。對分別攜帶blaCTX-M-15、blaCTX-M-64、blaCTX-M-123和blaCTX-M-132的四個質粒pHNY2-1、pHNAH46-1、pHNAH4-1和pHNLDH19進行高通量測序并分析其結構。結果發(fā)現，攜帶blaCTX-M-15的IncI2質粒pHNY2-1、攜帶blaCTX-M-55的質粒pHN1122-1、攜帶blaCTX-M-64的質粒pHNAH46-1和攜帶blaCTX-M-13

10、2的質粒pHNLDH19都含有相同的插入序列ISEcp1-blaCTX-M-IncA/C，并且質粒骨架幾乎一致，說明雜合基因可能起源于blaCTX-M-15。攜帶blaCTX-M-123的質粒pHNAH4-1為IncI1型（ST108），含有ISEcp1-blaCTX-M-IncA/C-IncI2片段，提示ISEcp1介導blaCTX-M-IncA/C-IncI2轉移到IncI1型質粒上。采用PCR測序及限制性內切酶片段長度多態(tài)性分析（