耐多藥大腸埃希菌攜帶CTX-M-14,CTX-M-15酶基因的檢查研究.pdf

1、目的:了解本地區(qū)耐多藥大腸埃希菌攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的CTX-M-14和CTX-M-15酶基因分布情況及對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物的耐藥情況，并對(duì)溴化乙啶(EB)消除耐藥質(zhì)粒的影響進(jìn)行探討。
　　方法:1.CTX-M-14和CTX-M-15酶基因的檢測(cè):1.1藥物敏感試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法（K-B法）:對(duì)來(lái)自本地區(qū)2007年7月-2008年7月期間細(xì)菌感染患者的大腸埃希菌71株，從中選出多耐25株、雙耐15株及單耐16株等共56株大腸埃希菌藥物敏感試驗(yàn)。1.

2、2 PCR技術(shù):提取質(zhì)粒DNA，以此為模板對(duì)CTX-M-14和CTX-M-15酶基因進(jìn)行擴(kuò)增。CTX-M-14引物序列為P1:5'-GAAAGAGAGTGCAACGGATG-3', P2:5'-ATTGGAAAGGGTTCATCACC-3';CTX-M-15引物序列為P1:5'-AAAAATCACTGCGCCAGTTC-3'，P2:5'-AGCTTATTCATCGCCACGTT-3'。PCR反應(yīng)體系:共26μl，其中摸板6μl，引物每對(duì)

3、各1μl，2×TaqPCR MasterMix12.5μl，ddH2O5.5μl。在混勻后，加入PCR反應(yīng)管，然后再放入PCR擴(kuò)增儀。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為:94℃預(yù)變性3分鐘，94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)完成后72℃延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖電泳，標(biāo)準(zhǔn)菌株25922進(jìn)行陰性對(duì)照，在紫外線檢測(cè)儀下看結(jié)果，并用凝膠成像儀攝像，最后送上海生工進(jìn)行基因測(cè)序。1.3 CTX-M-4和CTX-M

4、-15酶基因陽(yáng)性菌和陰性菌耐藥分析:即進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，對(duì)7種抗菌藥物對(duì)耐藥大腸埃希菌的CTX-M-14及CTX-M-15陽(yáng)性和陰性菌株耐藥情況比較。2.質(zhì)粒消除試驗(yàn):選取多耐組大腸埃希菌中取攜帶CTX-M-14陽(yáng)性大腸埃希菌21株，在含30μg/mlEB的培養(yǎng)液中粉餅振蕩培養(yǎng)64小時(shí)和120小時(shí)，分別進(jìn)行細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取，并使用PCR技術(shù)對(duì)目的基因CTX-M-14的檢測(cè)。對(duì)細(xì)菌質(zhì)粒消除前后作藥物敏感試驗(yàn)。
　　結(jié)果:1 CT

5、X-M-14和CTX-M-15酶基因的檢測(cè)1.1藥物敏感試驗(yàn):56株大腸埃希菌耐藥率分別為亞胺培南(IMP)0，阿米卡星(AMK)12.5％，頭孢他啶(CAZ)55.4％，左氧氟沙星(LEV)60.7％，慶大霉素(GEN)62.5％，氨曲南(AZT)71.4％，頭孢噻肟(CTX)83.9％。1.2 CTX-M-14和CTX-M-15酶基因檢測(cè)結(jié)果:兩者的檢出率分別78.6％，50.0％。其中在多耐藥大腸埃希菌中，檢出率分別為96.0％，

6、48.0％;在雙耐藥大腸埃希菌中，檢出率分別為53.3％，60.0％;在單耐藥大腸埃希菌中，檢出率分別為75.0％，43.8％。大腸埃希菌質(zhì)粒攜帶CTX-M-14菌株檢出率，多耐組(96.0％)和雙耐組(53.3％)比較，經(jīng)X2檢驗(yàn)，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;多耐組(96.0％)和單耐組+雙耐組(64.5％)檢出率的比較，經(jīng)X2檢驗(yàn)，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.3按細(xì)菌攜帶CTX-M-14，CTX-M-15型別分組后藥

7、物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果:耐藥大腸埃希菌的CTX-M-14陽(yáng)性和陰性菌株，對(duì)7種抗菌藥物耐藥情況比較，均為P＞0.05;耐藥大腸埃希菌的CTX-M-15陽(yáng)性和陰性菌株對(duì)氨曲南，頭孢噻肟耐藥率相比較，經(jīng)X2檢驗(yàn)，P值分別為0.018，0.029，P＜0.05，而對(duì)慶大霉素，阿米卡星，左氧氟沙星，頭孢他啶耐藥率相比較，經(jīng)X2檢驗(yàn)，均為P＞0.05;攜帶CTX-M-14，CTX-M-15酶基因的大腸埃希菌對(duì)頭孢噻肟與頭孢他啶的耐藥率比較，經(jīng)X2檢驗(yàn)，均

8、為P＜0.05，提示攜帶CTX-M-14，CTX-M-15酶基因的大腸埃希菌對(duì)頭孢噻肟耐藥率均高于頭孢他啶。2質(zhì)粒消除試驗(yàn)結(jié)果2.1質(zhì)粒消除試驗(yàn)后細(xì)菌質(zhì)粒CTX-M-14檢測(cè):21株多耐藥大腸埃希菌對(duì)含30μg/mlEB的培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)64小時(shí)，提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA，PCR技術(shù)目的基因CTX-M-14的檢測(cè)，結(jié)果顯示:細(xì)菌的質(zhì)粒中CTX-M-14酶基因沒(méi)消除;大腸埃希菌對(duì)含30μg/mlEB的培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)120小時(shí)，提取細(xì)菌質(zhì)粒DN

9、A，PCR技術(shù)目的基因CTX-M-14的檢測(cè)，結(jié)果顯示:21株細(xì)菌中，CTX-M-14酶基因只有1株轉(zhuǎn)為陰性。2.2質(zhì)粒消除試驗(yàn)前后藥物敏感情況比較:經(jīng)質(zhì)粒消除試驗(yàn)前后細(xì)菌耐藥率比較，經(jīng)X2檢驗(yàn)，對(duì)頭孢西丁，環(huán)丙沙星，哌拉西林，頭孢曲松，頭孢噻肟，頭孢他啶，P＞0.05，不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;質(zhì)粒消除試驗(yàn)前后細(xì)菌，對(duì)鏈霉素耐藥率比較，經(jīng)X2檢驗(yàn)，X2=11.958，P=0.001，P＜0.05，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:1.在耐藥大腸埃