乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠和多器官障礙綜合征模型的評價及藥物干預研究.pdf

1、乙型肝炎作為一種世界性的傳染病,尚無徹底根治的辦法。乙肝病毒(HBV)的宿主特異性給乙肝疾病模型的建立帶來了很大難度。目前的乙肝動物模型局限性在于所用動物與人類相比在進化上相去甚遠,而一般的哺乳動物又很難感染HBV。因此,建立一種穩(wěn)定可靠的乙肝動物模型對乙肝發(fā)生機制的研究和抗乙肝藥物的篩選具有重要意義。多器官功能障礙綜合征(MODS)作為一種臨床致死率較高的疾病,其發(fā)病機制尚無定論,目前普遍認為與機體內(nèi)皮細胞損傷所釋放的內(nèi)毒素導致多個器

2、官功能障礙有關(guān)。臨床上降低MODS死亡率的手段主要是積極干預各種會引起感染性休克的因素。而許多抗炎保肝天然產(chǎn)物,能有效抑制機體炎癥和內(nèi)毒素產(chǎn)生,緩解器官的病理損傷。
　　本課題第一部分以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象,首先驗證轉(zhuǎn)基因小鼠HBV DNA的復制和HBV抗原的表達情況,然后在體外細胞實驗抗乙肝研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型,探討了松果菊苷對HBV復制的影響。第二部分采用頸動脈穿刺放血和尾靜脈注射脂多糖兩次打擊

3、的方法,建立SD大鼠多器官功能障礙綜合征模型,并運用該模型探討了具有抗炎保肝作用的六棱菊提取物(LAE)對實驗性多器官障礙綜合征的改善作用。
　　一、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠病毒表達特性及松果菊苷抗HBV作用研究
　　1. HBV轉(zhuǎn)基因小鼠病毒表達特性研究
　　HBV轉(zhuǎn)基因小鼠源自正常小鼠受精卵經(jīng)顯微注射整合人類HBV全基因組后培育而成。為了評價轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的復制情況,抽提轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織和尾巴組織DNA,采用熒光定量

4、PCR方法擴增檢測HBV DNA水平,并采用ELISA方法檢測小鼠血清乙肝表面抗原(HBsAg)和E抗原(HBeAg)水平。通過檢測血清轉(zhuǎn)氨酶(GOT/GPT)水平和肝組織病理變化,了解轉(zhuǎn)基因小鼠的肝功能狀況。結(jié)果表明:HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織和血清HBV DNA水平在2.0×103~1.0×107 copies/ml之間;血清HBsAg和HBeAg呈陽性;轉(zhuǎn)基因小鼠血清GOT和GPT水平明顯高于正常小鼠;肝組織病理學檢查顯示病理學檢查顯

5、示局部細胞形態(tài)和排列出現(xiàn)輕微改變,肝動靜脈有擴張趨勢,與轉(zhuǎn)氨酶的升高相吻合。上述結(jié)果表明,HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的復制呈活躍狀態(tài),能夠在一定程度上模擬乙肝患者HBV的復制,可作為抗乙肝藥物評價的疾病模型。
　　2.松果菊苷體內(nèi)外抗HBV作用研究
　　松果菊苷對 HepG2.2.15細胞 HBV表達的影響:以 HBV基因轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細胞為模型,研究松果菊苷的體外抗HBV作用。將HepG2.2.15細胞接種于9

6、6孔板,每孔加入含不同濃度(100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml和1μg/ml)松果菊苷和陽性藥物拉米夫定的DMEM培養(yǎng)基,每種濃度設(shè)三個復孔。在37℃下培養(yǎng)3和6天后,采用ELISA法測定HBsAg和HBeAg水平;采用熒光定量PCR法測定HBV DNA水平。結(jié)果表明:松果菊苷作用HepG2.2.15細胞6天后,在50和100μg/ml濃度下能顯著抑制HBsAg和HBeAg表達,其最高抑制率分別為42.68

7、％和46.29%;同時對HBV DNA也具有抑制作用。
　　松果菊苷對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBV表達的影響:以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠為模型,研究松果菊苷的體內(nèi)抗HBV作用。將40只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為5組:對照組、拉米夫定(50 mg/kg)組、大劑量松果菊苷(50 mg/kg)組、中劑量松果菊苷(25 mg/kg)組和小劑量松果菊苷(12.5 mg/kg)組。每天灌胃給藥1次,對照組小鼠給予等劑量的生理鹽水,連續(xù)給藥30天。第31天小

8、鼠眼眶取血,分離血清分別檢測HBV DNA、HBsAg、HBeAg、GOT和GPT水平;解剖取其肝臟,提取肝組織DNA并測定其HBV DNA水平,同時制作肝組織病理學檢查。結(jié)果表明:50mg/kg劑量對血清HBV DNA有顯著抑制作用,但各劑量對肝組織HBV DNA水平均無顯著性影響。
　　上述結(jié)果表明,松果菊苷具有較明顯的體內(nèi)外抗HBV作用。
　　二、多器官功能障礙綜合征(MODS)模型的建立及其藥物干預研究
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9、. MODS大鼠模型的建立
　　選取雄性SD大鼠,體重在150-180 g之間。動物在建模前12小時開始禁食,以3%的戊巴比妥鈉1ml/kg體重腹腔注射麻醉;用一次性針筒抽取大鼠頸部動脈竇血液2 ml,對大鼠造成失血性休克創(chuàng)傷;放血后用生理鹽水3.5 ml/kg體重灌胃;再經(jīng)12小時后,尾靜脈注射7 ml/kg脂多糖(LPS),造成二次內(nèi)毒素刺激;然后每天用生理鹽水灌胃,連續(xù)三天。三天后從未死亡的造模大鼠中挑選符合多器官障礙體征的

10、大鼠,用于后續(xù)實驗研究。
　　2.六棱菊提取物(LAE)對MODS的干預作用研究
　　取MODS大鼠32只,隨機分為4組:模型組,LAE大劑量(100 mg/kg)組、LAE中劑量(50 mg/kg)組和LAE小劑量(25 mg/kg)組,試藥組以不同劑量的LAE每天灌胃,模型組給予等劑量的生理鹽水。連續(xù)給藥10天后,采取大鼠血液分離血清,測定超氧化物歧化酶(SOD)、B型鈉尿肽(BNP)、一氧化氮(NO)、肌酸激酶同工酶M

11、B(CK-MB)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、尿素氮(BUN)、白細胞介素6(IL-6)和內(nèi)毒素含量。結(jié)果顯示LAE對炎癥相關(guān)介質(zhì)具有顯著抑制作用,能有效緩解大鼠體內(nèi)炎癥,減少機體自由基,顯著改善心功能和肝功能。說明LAE對MODS具有明顯改善作用。
　　綜上所述,本論文研究了HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的病毒表達特性,并采用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,證明了松果菊苷的抗HBV作用;同時通過建立的MODS大鼠模型,探討了LAE對MODS的改善作用。有