FSGS患者血清對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、[目的]
　　 足細(xì)胞在維持腎小球正常結(jié)構(gòu)和生理功能方面具有重要作用。局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(focal segmental glomerular sclerosis,FSGS)是一種以足細(xì)胞損傷為特征的進(jìn)行性發(fā)展的腎小球硬化性疾病,足細(xì)胞損傷或丟失及功能障礙在FSGS的啟動(dòng)和發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。目前對(duì)FSGS研究相關(guān)證據(jù)表明“循環(huán)因子”是導(dǎo)致FSGS的致病因子。為探索“循環(huán)因子”對(duì)FSGS患者足細(xì)胞凋亡的影響,本研究擬以不同濃

2、度FSGS患者血清直接作用于離體小鼠永生化足細(xì)胞(MPC-5細(xì)胞),觀察FSGS患者血清對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響。目的在于探討“循環(huán)因子”在腎小球足細(xì)胞損傷中的作用,為下一步清除或抑制FSGS致病因子奠定理論基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.提取血清:收集我院2007年6月至2008年6月經(jīng)腎活檢確診為原發(fā)性FSGS并且未使用腎上腺皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療的患者30例,每人抽取10ml血液并提取血清,并從15例健康志愿者提取對(duì)

3、照血清,所有入選患者及志愿者均常規(guī)排除乙肝、丙肝及HIV病毒感染。所獲血清56℃滅活補(bǔ)體,抽濾滅菌,混勻后分裝于EP管中,-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定:細(xì)胞培養(yǎng)至分化2周,光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室其他成員用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定足細(xì)胞標(biāo)志蛋白,以證實(shí)為分化成熟的MPC-5細(xì)胞。
　　 3.分別用3種濃度的FSGS患者血清(5％、10%、20%)處理分化成熟的MPC-5細(xì)胞,其中5%、10%FSGS血

4、清組分別以正常人血清補(bǔ)足至總血清含量為20%,于24h、48h收集細(xì)胞。
　　 4.應(yīng)用乳酸脫氫酶(LDH)釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度FSGS患者血清對(duì)MPC-5細(xì)胞活性的影響。
　　 5.用分光光度法檢測(cè)不同濃度FSGS患者血清對(duì)MPC-5細(xì)胞Caspase-3酶活性水平的影響。
　　 6.用Hoechst33258染色法檢測(cè)不同濃度FSGS患者血清對(duì)MPC-5凋亡凋亡百分率的影響。
　　 [結(jié)果]
　

5、　 1.光鏡下分化成熟的足細(xì)胞出現(xiàn)二級(jí)足突,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室其他成員用細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)足細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)WT-1,nephrin,證明實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株來源為分化成熟足細(xì)胞。
　　 2.FSGS患者血清處理可升高M(jìn)PC-5細(xì)胞的LDH釋放率(p＜0.05),且呈劑量與時(shí)間依賴性。
　　 3.FSGS患者血清可升高M(jìn)PC-5細(xì)胞凋亡百分率(p＜0.05),且呈劑量與時(shí)間依賴性。
　　 4.FSGS患者血清處理可升高M(jìn)P