霉酚酸酯對(duì)糖尿病大鼠足細(xì)胞肥大及凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)以早期腎臟體積增大、晚期腎小球硬化為主要特征，腎臟細(xì)胞的增殖、肥大與凋亡參與了DN的發(fā)生、發(fā)展。本研究采用體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合的方法，通過觀察糖尿病大鼠及高糖刺激下的腎小球足細(xì)胞肥大、凋亡狀態(tài)，測(cè)定細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑(cyclin-kinaseinh ibitors，CKIs)p27kip1、p21cip1及凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax、

2、cleavedcaspase-3的表達(dá)，觀察霉酚酸酯(mycophenolate mo fetil，MMF)對(duì)足細(xì)胞肥大、凋亡的影響，為治療DN提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):32只雄性健康Wistar大鼠，腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ)，另外8只作為對(duì)照組(NC)。注射STZ72小時(shí)后剪尾采血，測(cè)血糖＞16.7mmol/L，尿糖陽性，表明糖尿病模型成功建立。將糖尿病造模成功的32只大鼠，隨機(jī)分為糖尿

3、病組(DM)、霉酚酸酯組(DM+M)、纈沙坦組(DM+V)及霉酚酸酯+纈沙坦聯(lián)合治療組(DM+M.V)，每組8只。成模2天后，治療組分別給予MMF15mg.kg-1.d-1，纈沙坦40mg.kg-1.d-1，聯(lián)合治療給予MMF15mg.kg-1.d-1+纈沙坦40mg.kg-1.d-1，1mg/d灌胃;而NC組和DM組每日予等量溶媒灌胃，共16周(w)。分別檢測(cè)五組大鼠4w、8w及16w的左腎重/體重、血糖、血壓、內(nèi)生肌酐清除率及24小

4、時(shí)尿蛋白排泄量;光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察糖尿病大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的變化;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎皮質(zhì)nephrin、WT1蛋白的表達(dá);TUNEL法檢測(cè)足細(xì)胞的凋亡率;Western-blot半定量及熒光實(shí)時(shí)定量PCR的分析方法，檢測(cè)腎組織中p27kip1、p21cip1及bcl-2、bax、cleavedcaspase-3的表達(dá)。
　　體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):訂購的小鼠腎足細(xì)胞，按培養(yǎng)液中葡萄糖、霉酚酸(mycophenolicacid，MPA

5、)、纈沙坦的含量不同分為:①正常對(duì)照組NG(葡萄糖濃度5.6mmol/L+2.5％FBS的DMEM);②高糖組HG（葡萄糖濃度25mmol/L）;③HG+M組:HG(葡萄糖濃度25mmol/L)+MPA2.5×10-7mol/L;④HG+V組:HG（葡萄糖濃度25mmol/L）+纈沙坦10-7mol/L;作用72小時(shí)(h)。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定12h、24h、48h、72h各時(shí)間點(diǎn)足細(xì)胞的肥大指數(shù)及凋亡率，運(yùn)用Western-blot半定

6、量及熒光實(shí)時(shí)定量PCR的分析方法，檢測(cè)腎小球足細(xì)胞中p27kip1、p21cip1及bcl-2、bax、cleavedcaspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.臨床參數(shù)
　　與NC組比較，DM大鼠血糖明顯升高、體重減輕、肥大指數(shù)增加，24小時(shí)尿蛋白排泄量及肌酐清除率均明顯增高（P＜0.01）。16周末，DM大鼠腎重/體重指數(shù)較NC組明顯升高（8.49±1.21vs4.57±0.82，P＜0.01）;而霉酚酸酯和/

7、或纈沙坦治療16w后，腎重/體重指數(shù)明顯降低，差異有顯著性（P＜0.01）;但各藥物治療組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。16w末，DM大鼠尿蛋白量較NC組明顯升高（55.37±2.33vs10.52±0.66，P＜0.05）;同樣藥物治療16w后，24小時(shí)尿蛋白排泄量明顯降低，差異有顯著性（P＜0.01）;各給藥組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　2.腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察
　　光鏡:4周前糖尿病大鼠無明顯變化。此后，隨著

8、實(shí)驗(yàn)周期的延長(zhǎng)，糖尿病大鼠腎小球的體積逐漸增大、系膜區(qū)逐漸增寬，且基底膜增厚、毛細(xì)血管腔受壓、變窄;與NC組比較，16周末DM組腎小球的硬化指數(shù)（1.15±0.12vs0.15±0.05，P＜0.01）及間質(zhì)纖維化積分（0.58±0.08vs0.12±0.04，P＜0.01）明顯增加，其差異有顯著性;各藥物治療組較DM組均有不同程度的改善。
　　電鏡:糖尿病大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜均質(zhì)性增厚和系膜基質(zhì)增多，伴足細(xì)胞足突的廣泛融合，

9、并可見裸露的基底膜及脫落的足細(xì)胞。MMF和/或纈沙坦治療后，足突的融合減輕，系膜基質(zhì)及足細(xì)胞的脫落均明顯減少。
　　3.腎組織中nephrin、WT-1蛋白及mRNA的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)染色顯示:正常大鼠nephrin、WT1沿腎小球基底膜呈棕黑色線形分布，而糖尿病大鼠的線樣沉積變淡、變細(xì)、甚至消失，經(jīng)MMF和/或纈沙坦治療后，其線樣沉積又恢復(fù)至粗線狀。
　　從第4周開始糖尿病組大鼠腎組織中nephrin蛋白(2.

10、08±0.42vs2.63±0.51，P＜0.05)及WT1蛋白(1.26±0.2vs1.59±0.26，P＜0.05)的表達(dá)減少，且隨著時(shí)間的推移nephrin、WT1蛋白的表達(dá)進(jìn)一步降低。各治療組與DM組比較，nephrin、WT1的表達(dá)均有不同程度的升高（P＜0.05）;且16w末nephrin蛋白的表達(dá)DM+M組(1.83±0.43)及DM+M.V組(1.75±0.31)療效優(yōu)于DM+V組(1.39±0.28)，有顯著性差異（P

11、＜0.05）;而各藥物治療組間WT1蛋白的表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。
　　從第4周開始DM組大鼠腎組織中nephrinmRNA（0.87±0.13vs0.95±0.091，P＜0.05）、WT1mRNA（0.92±0.095vs1.04±0.079，P＜0.05）的表達(dá)下降，且隨著時(shí)間的推移其mRNA的表達(dá)進(jìn)一步降低。而經(jīng)霉酚酸酯和/或纈沙坦治療后，nephrin、WT1mRNA的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)（P＜0.05)，16

12、周末WT1mRNA的表達(dá)霉酚酸酯聯(lián)合治療組(1.30±0.25)優(yōu)于纈沙坦組(1.04±0.23)，（P＜0.05），而nephrinmRNA的表達(dá)三治療組間比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　4.足細(xì)胞肥大指數(shù)
　　高糖組足細(xì)胞肥大從24小時(shí)開始(0.828±0.23vs0.678±0.16，P＜0.05)，且隨著時(shí)間的推移足細(xì)胞進(jìn)一步肥大。各治療組與高糖組比較，霉酚酸治療組足細(xì)胞肥大從24小時(shí)開始減輕，而纈沙坦治療組從

13、48小時(shí)開始明顯減輕，且隨著時(shí)間推移，療效逐漸增強(qiáng)（P＜0.05）。
　　5.p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA的表達(dá)
　　體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):從第4周開始DM組大鼠腎組織中p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，與正常對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，16周末達(dá)高峰。各治療組與DM組比較，p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA的表達(dá)從第8周開始降低（P＜0.05），且隨著實(shí)驗(yàn)周期的延長(zhǎng)，p2

14、7kip1、p21xip1蛋白及mRNA的表達(dá)進(jìn)一步降低;16w末p27kip1蛋白、mRNA及p21cip1mRNA的表達(dá)，霉酚酸酯+纈沙坦聯(lián)合治療組優(yōu)于纈沙坦組(P＜0.05)。
　　體外足細(xì)胞培養(yǎng):p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA的表達(dá):從24小時(shí)開始，HG組小鼠足細(xì)胞p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA水平開始升高，與NG組相比差異有顯著性(P＜0.05)。且隨著時(shí)間的推移，p27kip1和p21cip

15、1蛋白及mRNA的表達(dá)進(jìn)一步升高。霉酚酸及纈沙坦可明顯降低p27kip1和p21cip1蛋白的表達(dá)，且72小時(shí)末p27kip1蛋白的表達(dá)霉酚酸的療效優(yōu)于纈沙坦（P＜0.05）;霉酚酸和纈沙坦亦可明顯降低p27kip1mRNA的表達(dá)，而p21cip1mRNA的表達(dá)僅霉酚酸起到明顯的抑制作用。
　　6.足細(xì)胞凋亡率
　　體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)第8周糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡率開始增高（2.63±0.31vs0.84±0.26，P＜0.01

16、），且隨著實(shí)驗(yàn)的延長(zhǎng)，足細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增高。各治療組與DM組相比，均有不同程度的下降;16周末霉酚酸酯單一治療組(1.81±0.27)及聯(lián)合治療組(1.24±0.19)優(yōu)于纈沙坦組(2.25±0.33)，差異有顯著性（P＜0.05）。
　　體外足細(xì)胞實(shí)驗(yàn):高糖培養(yǎng)48小時(shí)后，足細(xì)胞凋亡率明顯高于NG組(4.97±0.58vs2.77±0.31，P＜0.05)。兩治療組，僅霉酚酸治療72小時(shí)后足細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），而纈

17、沙坦治療組無變化（P＞0.05），且72小時(shí)末霉酚酸的療效優(yōu)于纈沙坦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　7.bax、bcl-2、cleavedcaspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)
　　體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):糖尿病大鼠的bax、cleavedcaspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)從實(shí)驗(yàn)第8周起明顯升高，而bcl-2的表達(dá)下降，差異有顯著性（P＜0.05）。各治療組與DM組比較，其表達(dá)均有不同程度的改善;且16周末bax/bcl

18、-2蛋白的表達(dá)，DM+M組(1.42±0.2)、DM+M.V組(1.57±0.26)與DM+V(1.95±0.24)比較差異有顯著性，（P＜0.01）。
　　體外足細(xì)胞培養(yǎng):高糖培養(yǎng)下，足細(xì)胞的bax、cleavedcaspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)從實(shí)驗(yàn)第48小時(shí)起升高，而bcl-2的表達(dá)下降，差異有顯著性（P＜0.05），且隨著時(shí)間的推移比值進(jìn)一步升高。經(jīng)霉酚酸或纈沙坦治療后，其比值較HG組下降，差異有顯著性（P＜0.01

19、）;且72小時(shí)末bax/bcl-2、cleavedcaspase-3蛋白的表達(dá)，HG+M組較HG+V組明顯降低，差異有顯著性（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.足細(xì)胞的肥大與凋亡參與了糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。糖尿病早期，足細(xì)胞的肥大伴隨著細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p27kip1、p21cip1表達(dá)的增高。隨著糖尿病病程的進(jìn)展，足細(xì)胞的凋亡率增高，晚期的腎小球硬化與其過度凋亡有關(guān)，并伴隨著凋亡相關(guān)基因bax、cleavedca

20、spase-3表達(dá)的升高及bcl-2表達(dá)的降低。
　　2.霉酚酸酯和纈沙坦可有效的抑制腎小球足細(xì)胞的肥大與凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（p27kipp1、p21cip1）和凋亡相關(guān)基因（bax、bcl-2、cleavedcaspase-3）的表達(dá)，起到一定的保護(hù)作用。因此，推測(cè)霉酚酸酯可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控蛋白p27kip1、p21cip1及凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2及cleavedcaspase-3的表達(dá)，抑制和阻斷腎小