姜黃素誘導(dǎo)人食管癌Ec-9706細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，我國是食管癌的高發(fā)國家，每年因食管癌死亡的人數(shù)占全部惡性腫瘤死亡的近四分之一。目前治療食管癌除早期手術(shù)，化學(xué)藥物已成為治療惡性腫瘤的重要方法，但是絕大多數(shù)化學(xué)藥物的細(xì)胞毒作用缺乏特異性，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，無選擇的殺傷正常細(xì)胞。因此，尋找毒副作用小，抗瘤活性強(qiáng)的化療藥物已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。姜黃素是從姜黃屬植物姜黃的根莖中提取的一種植物多酚，可用于食品上色及佐味。近年研究發(fā)現(xiàn)其藥理作用廣泛，如

2、抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、抗動(dòng)脈硬化及抗腫瘤等作用。尤其姜黃素可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，作為一種具有良好發(fā)展前景的抗癌藥物，日益引起人們的關(guān)注，但對人食管癌的作用及分子機(jī)制研究較少，本研究通過體外培養(yǎng)人食管癌Ec-9706細(xì)胞，研究姜黃素作用后細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因表達(dá)的影響，探討姜黃素在食管癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，為食管癌的化學(xué)防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 腫瘤發(fā)生不僅是瘤細(xì)胞的過度增生，還存在死亡過少，凋亡機(jī)制障礙，細(xì)胞凋亡參與腫

3、瘤起始過程，并對腫瘤發(fā)生發(fā)展起負(fù)調(diào)控作用。本研究運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對細(xì)胞凋亡中凋亡抑制蛋白因子(Livin)，促凋亡因子(Smac)和Caspase-3進(jìn)行檢測和分析，以期進(jìn)一步闡明細(xì)胞凋亡調(diào)控基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法：將Ec-9706細(xì)胞于37℃，飽和濕度5％CO2的常規(guī)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后用于實(shí)驗(yàn)。 1.應(yīng)用光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：將不同濃度的姜黃素作用于Ec-9706細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下

4、定時(shí)觀察細(xì)胞的生長情況并照相。 2.采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測藥物對細(xì)胞的生長抑制作用。 3.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分布：收集經(jīng)不同濃度姜黃素作用12h、24h、48h的Ec-9706細(xì)胞及對照組細(xì)胞，冷PBS漂洗。預(yù)冷70％乙醇4℃，固定，上機(jī)檢測前離心去固定液，0.5％胃蛋白酶消化，碘化丙錠(PropidiumIodide，PI：50mg/L Trinton X-100 1.0％)室溫避光

5、染色。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，應(yīng)用軟件進(jìn)行分析。 4 FCM檢測caspase-3蛋白的表達(dá)：收集經(jīng)不同濃度姜黃素作用12h、24h、48h的Ec-9706細(xì)胞及對照組細(xì)胞，按常規(guī)方法進(jìn)行熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，以熒光指數(shù)(FI)表示蛋白的表達(dá)情況。 5 應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察細(xì)胞凋亡調(diào)控因子Smac、Caspase3蛋白表達(dá)的變化。 6 western blot半定量檢測基因蛋白Livin、Smac、C

6、aspase3表達(dá)，并分析各蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性及其在姜黃素抗食管癌中的作用機(jī)制。 結(jié)果： 姜黃素對Ec-9706細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因的影響 1.經(jīng)40、80、120、160μmol/ml姜黃素處理Ec-9706細(xì)胞12h、24h和48h后，倒置相差顯微鏡下觀察，與對照組相比，用藥組的細(xì)胞生長明顯被抑制，胞漿內(nèi)顆粒增多增粗，核漿比例降低，部分細(xì)胞變圓而懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。提示Ec-9706細(xì)胞趨于凋亡。 2.

7、分別用姜黃素(0、40、80、120、160μmol/ml)作用于Ec-9706細(xì)胞12、24、48h，MTT結(jié)果顯示姜黃素能明顯抑制Ec-9706細(xì)胞的增殖，并呈劑量和時(shí)間依賴性。作用12h、24h和48h后，Ec-9706細(xì)胞半數(shù)抑制率(inhibitory concentration giving 50％inhibition，IC50)分別為216.1447μmol/ml ，148.0635μmol/ml和113.8045μmol

8、/ml(p＜0.01)。最高增殖抑制率為：應(yīng)用160μmol/ml姜黃素處理Ec-9706細(xì)胞48小時(shí)后，其增殖抑制率達(dá)到73.19％。溶劑對細(xì)胞生長未見明顯影響(P＞0.05)。 3.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡，在DNA組方圖上出現(xiàn)典型的亞二倍體峰即“凋亡峰”。40、80、120和160μmol/ml姜黃素作用12h后的凋亡率分別為6.01±1.04％、9.26±2.11％、13.31±1.54％和20.16±2.85％，與對照組

9、的1.70±0.32％相比，差異有顯著性(P＜0.05)。藥物作用24h后的凋亡率分別為8.74±0.98％、11.63±1.74％、21.67±2.34％、36.17±2.78％，與對照組的2.12±0.48％相比，差異有顯著性(P＜0.01)。藥物作用48h后凋亡率分別為9.14±1.62％、17.74±1.87％、30.82±2.48％和44.35±3.42％，與對照組的2.87±0.54％相比，差異有顯著性(P＜0.01)。并做

10、各用藥濃度組作用不同時(shí)間細(xì)胞凋亡率的方差分析，表明差異有顯著性(P＜0.05)。pearson關(guān)聯(lián)性分析，劑量依賴(r=0.8371，P＜0.01)與時(shí)間依賴(r=0.6912，P＜0.01)。說明Ec-9706細(xì)胞凋亡率與姜黃素作用呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。姜黃素作用后，Ec-9706細(xì)胞在細(xì)胞周期中的分布發(fā)生了明顯的變化，隨著作用時(shí)間延長和藥物濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞數(shù)逐漸增加，S和G2/M期細(xì)胞數(shù)逐漸減少。經(jīng)藥物濃度和作用時(shí)間方差

11、分析，差異有顯著性(P＜0.05)。pearson關(guān)聯(lián)性分析，劑量依賴(r=0.7147，P＜0.01)與時(shí)間依賴(r=0.6912，P＜0.05)。 4 FCM檢測姜黃素作用后Caspase-3蛋白表達(dá)用0、40、80、120和160gmol/ml姜黃素處理細(xì)胞，于12、24h和48h收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測Caspase-3蛋白表達(dá)。Caspase-3蛋白平均熒光指數(shù)(FI)：12h組蛋白表達(dá)分別為(1.00±0.00)(

12、1.05±0.07)(1.18±0.04)(1.23±0.09)(1.72±0.11)；24h組分別為(1.00±0.03)(1.27±0.04)(1.43±0.04)(1.89±0.07)(2.11±0.13)；48h組分別為(1.00±0.02)(1.31±0.05)(1.81±0.03)(2.09±0.08)(2.35±0.07)，與對照組比較，均有顯著性差異(P＜0.01)。隨著藥物濃度、作用時(shí)間的增加，Caspase-3表達(dá)逐

13、漸增高，呈正相關(guān)關(guān)系，劑量依賴(r=0.8722，P＜0.01)，時(shí)間依賴(r=0.7261，P＜0.05)。 5 0、40、80、120、160μmol/ml姜黃素對Ec-9706細(xì)胞分別作用12、24、48h小時(shí)后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，對照組中，Smac和Caspase3蛋白在細(xì)胞中呈弱陽性表達(dá)，姜黃素作用后，細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平明顯升高。 6 western blot半定量檢測基因蛋白表達(dá)，隨著姜黃素藥物濃度的增高

14、，Smac、Caspase3表達(dá)水平逐漸升高，Livin表達(dá)水平逐漸降低，而且有明顯的量效依賴關(guān)系。 結(jié)論： 1.姜黃素可明顯抑制人食管癌Ec-9706細(xì)胞的增殖，并使細(xì)胞周期受到阻滯，進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。抑制細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。 2.人食管癌Ec-9706細(xì)胞中存在Livin蛋白的高表達(dá)，姜黃素作用后Livin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，減弱了其對細(xì)胞凋亡的負(fù)性調(diào)控，從而誘導(dǎo)腫

15、瘤細(xì)胞凋亡。 3.姜黃素作用后Smac蛋白表達(dá)上調(diào)，Smac蛋白表達(dá)水平增高，促進(jìn)了解除livin對Caspase的抑制效應(yīng)而激活procaspase-3，成為有活性的Caspase-3，發(fā)揮其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。 4 Caspase-3蛋白隨藥物濃度的增高及作用時(shí)間的延長而表達(dá)量明顯升高。Caspase-3經(jīng)蛋白水解作用而被激活，從而產(chǎn)生了Caspase自我放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而裂解DNA損傷細(xì)胞，發(fā)生腫瘤細(xì)胞的凋亡。