特異核基質(zhì)蛋白在人食管癌EC9706細胞凋亡中作用的初步研究.pdf

1、本論文以姜黃素(curcumin，Cur)處理人食管癌EC9706細胞，在鑒定姜黃素對人食管癌EC9706細胞凋亡誘導(dǎo)效果的基礎(chǔ)上，綜合應(yīng)用亞細胞蛋白質(zhì)組學分析、免疫細胞化學、細胞分子生物學等技術(shù)，對EC9706細胞凋亡過程中核基質(zhì)蛋白的變化進行了較為系統(tǒng)的研究。分析鑒定和確證與EC9706細胞凋亡相關(guān)的特異核基質(zhì)蛋白，并研究特異核基質(zhì)蛋白與人食管癌EC9706細胞凋亡相關(guān)基因在細胞內(nèi)的共定位關(guān)系與變化，探索它們在人食管癌細胞凋亡誘導(dǎo)過

2、程中的調(diào)控作用，以期能夠在較為整體水平上進一步認識人食管癌細胞癌變與凋亡機理問題，從而找出人食管癌細胞凋亡相關(guān)的靶向性蛋白和深入探索的研究方向。 實驗結(jié)果表明，經(jīng)30μmol/L姜黃素處理之后，EC9706細胞增殖受到明顯抑制，細胞生長抑制率達83.88％，細胞發(fā)生G0/G1期阻滯。光鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)姜黃素誘導(dǎo)處理后的EC9706細胞出現(xiàn)了細胞體積縮小、核質(zhì)比例減小、細胞核固縮、核內(nèi)染色質(zhì)凝聚等顯著的細胞凋亡特征。瓊脂糖凝膠電

3、泳顯示EC9706細胞出現(xiàn)凋亡典型的DNA梯狀條帶。Hoechst染色顯示細胞核內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光。免疫細胞化學檢測結(jié)果顯示，經(jīng)姜黃素處理后，EC9706細胞內(nèi)的抑凋亡基因bcl-2表達下調(diào)，促凋亡基因bax、p53、fas等表達上調(diào)。雙向凝膠電泳與質(zhì)譜分析共鑒定12種蛋白，其中在凋亡的EC9706細胞中表達上調(diào)的有：Transcription elongation factor A(SII)-like4(TCEAL4

4、)、CCT8protein、Tara等3種核基質(zhì)蛋白；表達下調(diào)的有：Prohibitin、Spindling-2B、Nucleophosmin、Translation initiation factor eIF-2B subunit beta等9種核基質(zhì)蛋白。并進一步通過蛋白免疫印跡確證了Nucleophosmin、Prollibin、HSP70、Spindling-2B、Vimentin等核基質(zhì)蛋白的變化。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示特異

5、核基質(zhì)蛋白Nucleophosmin、Prohibitin、HSP70、Spindling-2B等與抑凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)均存在一定的共定位關(guān)系，并且它們的表達水平和細胞定位在細胞凋亡誘導(dǎo)前后均發(fā)生了改變。 研究結(jié)果表明，30μmol/L姜黃素對人食管癌EC9706細胞凋亡具有顯著誘導(dǎo)作用，并上調(diào)促凋亡基因bax、p53、fas的表達和下調(diào)抑凋亡基因bcl-2的表達。在EC9706細胞凋亡過程中，

6、其核基質(zhì)蛋白組成產(chǎn)生了TCEAL4、CCT8 protein、Tara等3種蛋白表達上調(diào)和Prohibitin、Spindling-2B、Nucleophosmin等9種蛋白表達下調(diào)的明顯變化。其中，差異表達核基質(zhì)蛋白Nucleophosmin、Prohibitin、HSP70、Spindling2B與EC9706細胞中Bcl-2和Bax蛋白均存在共定位關(guān)系，并在細胞凋亡過程中出現(xiàn)移位和分布的改變。由此證實了與人食管癌細胞凋亡相關(guān)的特異