RNAi沉默食管癌EC9706細胞DNA聚合酶β表達的初步研究.pdf

1、背景 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是環(huán)境因素與宿主因素相互作用的結(jié)果，細胞對致癌物的敏感性和自身突變的修復(fù)能力直接影響細胞癌變的幾率。DNA聚合酶β(DNApolymeraseβ)是一條39KD的單條肽鏈小分子蛋白質(zhì)，該聚合酶高度保守，結(jié)構(gòu)上可分為兩部分：8KD的氨基末端和31KD的羧基末端。DNA polβ被認為主要是在堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)的過程中填補單核苷酸缺口，包括短片段BER和長片段BER，

2、是目前DNA聚合酶中錯配率最高的一種酶，并且在氧化損傷的過程中發(fā)揮重要作用。由于DNA聚合酶β(DNApolβ)在催化堿基時的高錯誤率，故它的表達水平過低、過高、或突變的形成都可引起遺傳的不穩(wěn)定性，造成突變積累，促使細胞的癌變。DNA Polβ的高表達干擾了體內(nèi)多種修復(fù)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致DNA突變率和癌癥易感性增加；高表達的DNA polβ與腫瘤細胞耐藥性以及基因組不穩(wěn)定性有一定關(guān)系。DNA polβ缺陷會降低細胞的DNA堿基切除修復(fù)(BE

3、R)能力，導(dǎo)致對甲基甲磺酸(MMS)的高敏感性，同時甲基甲磺酸或氧化劑等均可誘導(dǎo)DNA polβ的表達。除了在堿基切除修復(fù)中發(fā)揮作用外，DNA polβ還涉及細胞周期和細胞分化，可能參與DNA復(fù)制、重組、與基因組穩(wěn)定性的維持、癌細胞對某些藥物的耐藥性等有關(guān)。 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的一門新興的在轉(zhuǎn)錄水平上的基因阻斷技術(shù)，是一種雙鏈RNA(double-stranded RN

4、A,dsRNA)分子在mRNA水平上關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達或使其沉默的過程，在基因功能研究和基因治療方面已經(jīng)顯示了巨大的應(yīng)用前景。 目的 本研究旨在探討RNA干擾表達載體(small interference RNA expression vector)對食管癌EC9706細胞中DNA p01p基因的抑制作用，通過腫瘤細胞體外實驗了解siRNA表達載體能否沉默食管癌細胞DNA polβ基因及沉默效果，為今后提高腫瘤細胞對

5、藥物的敏感性提供了理論依據(jù)和實驗依據(jù)。 實驗方法 利用Invivogen公司提供的計算機設(shè)計軟件，根據(jù)DNA polβcDNA編碼序列(M13140)，從DNA polβ mRNA基因中選擇2段19個堿基的特異性序列GGAAGTTTGTAGATGAAGG和TATGAGAGCTCATGCCAAG，分別設(shè)計2對66nt的寡核苷酸；每對66nt寡核苷酸退火后形成兩端各帶Bgl Ⅱ和HindⅢ酶切位點的雙鏈；分別將STL1(退火

6、形成的雙鏈DNA片斷siRNApolβ448)、STL2(退火形成的雙鏈DNA片斷siRNApolβ954)用2.0﹪低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收，分別與pGEM-T easy載體連接，得到克隆重組子pGEM-T-STL2和pGEM-T-STLl；用T4連接酶將目的片段pGEM-T-siRNApolβ448和pGEM-T-siRNApolβ954與線性化的表達載體pSuper．gfp/neo連接；利用PCR擴增法篩選鑒定得到重組的siRNA

7、表達載體pSuper．gfp/neo-siRNApolβ448和pSuper．gfp/neo-siRNApolβ954，并對其進行DNA序列分析。將表達載體pSuper．gfp/neo-siRNApolβ448和pSuper．gfp/neo-siRNApolβ954以及空白載體pSuper．gfp/neo分別轉(zhuǎn)染入食管癌EC9706細胞中，用熒光定量PCR方法檢測未轉(zhuǎn)染細胞與轉(zhuǎn)染細胞中DNA polβmRNA表達水平的變化；用流式細胞儀

8、檢測未轉(zhuǎn)染細胞與轉(zhuǎn)染細胞的細胞周期變化；用臺盼藍拒染實驗檢測順鉑、博萊霉素、甲基藍、雙氧水影響下未轉(zhuǎn)染細胞與轉(zhuǎn)染細胞死亡比率的變化。 實驗結(jié)果 1.遵循siRNA片段的設(shè)計原則，最終確定DNA polβ448-466位(GGAAGTTTGTAGATGAAGG)和954-972位(CCTTCATCTACAAACTTCC)為靶序列。 2.siRNA 表達質(zhì)粒載體pSuper．gfp/neo-siRNApolβ448

9、和pSuper．gfp/neo-siRNApolβ954經(jīng)bgl Ⅱ和hindⅢ雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)2﹪瓊脂糖凝膠電泳鑒定出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)先估計的片斷大小一致。 3．轉(zhuǎn)染后的EC9706細胞在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白在細胞內(nèi)廣泛表達，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定表達的細胞。 4．DNA聚合酶β基因的．mRNA表達水平在轉(zhuǎn)染靶向siRNA的實驗組1(轉(zhuǎn)染pSuper．gfp/neo-siRNApolp448 的 EC97

10、06 細胞)和實驗組 2(轉(zhuǎn)染 pSuper．gdp/neo-siRNApolp954的EC9706細胞)中較空白對照組和空載體對照組相比均顯著降低，統(tǒng)計學(xué)方面有高度顯著性差異(P<0.01)，實驗組2中mRNA表達水平較實驗組1顯著降低，在統(tǒng)計學(xué)方面也存在顯著差異(P<0.05,P=0．37)；空白對照組和空載體對照組中都存在較高水平的polβmRNA表達，二者在統(tǒng)計方面無顯著性差異(P>0.05)； 5．實驗組1和實驗組2細

11、胞的S期都與空載體組和空白對照組有高度顯著性差異(P<0.01)，說明轉(zhuǎn)染后細胞的S期比例顯著增加，細胞增殖率升高。但實驗組1和實驗組2之間無差異(P>0.05，)，說明EC9706細胞DNApolβ表達水平降低至本研究范圍對細胞增殖率沒有太大影響。 6．順鉑加藥組濃度小于60μmol/l時，四組細胞死亡率進行比較沒有顯著性差異(P>0.05)，隨著藥物濃度逐漸增加，死亡率開始出現(xiàn)高度顯著性差異(P<0.01)結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

12、博萊霉素加藥組和甲基藍加藥組從各自起始濃度開始，四種細胞死亡比率就存在高度顯著性差異(P<0.01)結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。雙氧水加藥組藥物濃度小于120μmol/l時，四組細胞死亡率進行比較沒有顯著性差異(P>0.05)，隨著藥物濃度逐漸增加，死亡率開始出現(xiàn)高度顯著性差異(P<0.01)結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義．從而為利用RNA干擾提高腫瘤細胞對藥物的敏感性提供初步實驗證據(jù)。 結(jié)論 1．成功構(gòu)建出 DNA polβ靶向的 siRNA

13、 真核表達載體 pSuper．gfp/neo-siRNApolβ448和pSuper．gfp/neo-siRNApolβ954，二者轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞后能顯著降低細胞polpmRNA的表達，說明構(gòu)建的2個siRNA真核表達載體對DNA polβ有高效和特異的沉默作用，且前者作用更強。 2．初步證實食管癌EC9706細胞中DNA polβ過低水平表達不利于維持細胞的生物學(xué)特性，細胞增殖率升高，對藥物敏感性增加；通過RNA干