食管癌細(xì)胞EC-1DNA聚合酶β啟動(dòng)子堿基突變對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的影響.pdf

1、授予單位代碼:學(xué)號(hào)或申請(qǐng)?zhí)?10459200612026071010002文學(xué)論大位州學(xué)鄭士碩(科學(xué)學(xué)位)食管癌細(xì)胞EC一IDNA聚合酶p啟動(dòng)子堿基突變對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的影響院系名稱:基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)位類別:醫(yī)學(xué)專業(yè)名稱:生物化學(xué)與分子生物作者姓名:王歡導(dǎo)師姓名、職稱:李月白教授二零零九年五月鄭州大學(xué)2009屆碩士學(xué)位論文食管癌細(xì)胞硯一IDNA聚合酶p啟動(dòng)子堿基突變對(duì)姿軍最活性的影響p啟動(dòng)子報(bào)告基因載體、突變型DNApolp啟動(dòng)子報(bào)告基因載體在

2、腫瘤細(xì)胞(EC一1和Eca9706細(xì)胞)和正常永生化細(xì)胞中啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱，以此探討食管癌細(xì)胞株EC一1中DNApolp啟動(dòng)子的突變形式對(duì)其啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，以證實(shí)腫瘤細(xì)胞中是否具有促進(jìn)DNApolp啟動(dòng)子活性增加的作用因素。材料與方法1.提取食管癌細(xì)胞株EC一1和永生化細(xì)胞293T細(xì)胞基因組ONA:按照AXYGEN質(zhì)粒小量提取試劑盒的操作規(guī)程提取2種細(xì)胞基因組DNA。2.擴(kuò)增食管癌細(xì)胞株EC一1和293丁細(xì)胞DNAPop基因啟動(dòng)子片

3、段并確定突變位點(diǎn):設(shè)計(jì)擴(kuò)增polp基因啟動(dòng)子引物，PCR擴(kuò)增食管癌細(xì)胞株EC一1和293T細(xì)胞polp基因核心啟動(dòng)子片段，與pGEM一TEasy質(zhì)粒連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌筋子~sa，通過(guò)。互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)以及采用通用引物T7SP6行PCR以鑒定重組子pGEM一T一p。lppromoter是否轉(zhuǎn)入。正反雙向測(cè)序后，采用DNASIS、OM工GA軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank查到DNApolp啟動(dòng)子序列進(jìn)行同源性比較，分析確定食管癌細(xì)胞株EC一1和

4、293T細(xì)胞是野生型或突變型polp啟動(dòng)子并確定突變位點(diǎn)。3.構(gòu)建含食管癌細(xì)胞株〔C一1和永生化細(xì)胞293T細(xì)胞pep基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體并鑒定:將已提取并測(cè)序正確的重組T載體(pGEM一T一polppromoter)和熒光素酶報(bào)告基因載體poL3一neo一enhaneer，用腸01和去刀刀djl分別做雙酶切，回收純化的雙粘Polp啟動(dòng)子目的片段，亞克隆至雙粘線性PGL3一neo一enhancer熒光素酶報(bào)告基因載體，得到重

5、組質(zhì)粒pGL3一neo一polpPromoter。質(zhì)粒pGL3一neo一polppromoter經(jīng)乃01和Hl’nd111雙酶切和PCR鑒定后，正反雙向測(cè)序以鑒定構(gòu)建的含食管癌細(xì)胞株EC一1和永生化293T細(xì)胞polp基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的正確性，并確認(rèn)突變存在位點(diǎn)仍然正確。即構(gòu)建成分別含永生化293T細(xì)胞和食管癌細(xì)胞株EC一IPolp基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體(pGL3一neo一293TpolpPromote