TGF-β-Smad信號對人橫紋肌肉瘤細胞RD生長和凋亡調(diào)控的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)是一種多功能的細胞因子，在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡、細胞外基質(zhì)形成、細胞移動、粘附、胚胎發(fā)育、組織器官形態(tài)發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用。TGF-β通過與細胞膜受體結(jié)合，將信號傳遞到下游分子Smad，磷酸化的Smad分子入核，調(diào)控相關(guān)基因的表達，從而發(fā)揮其生物學效應(yīng)。TGF-β對細胞生長和凋亡的調(diào)控具有細胞類型的特異性。TGF-β/Smad信號的喪失或轉(zhuǎn)導異常常與

2、腫瘤的發(fā)生、進展有關(guān)。目前，對TGF-β/Smad信號通路的研究主要集中在上皮性腫瘤和血液腫瘤上，對其在軟組織腫瘤中的調(diào)控作用及機制的研究國內(nèi)外均少見報道。 橫紋肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma，RMS)是兒童期常見的軟組織腫瘤。其發(fā)病率一般占軟組織惡性腫瘤的10～20％。RMS生長迅速，易早期發(fā)生血道轉(zhuǎn)移，盡管采取手術(shù)治療和聯(lián)合放化療，有轉(zhuǎn)移發(fā)生的患者約90％以上在5年內(nèi)死亡。RMS可以產(chǎn)生多種生長因子，其介導的異常信

3、號與RMS細胞的生長、分化、凋亡有關(guān)。明確這些生長因子如何對RMS細胞進行調(diào)控將為腫瘤的治療提供新的思路和策略。 本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)：腺泡狀橫紋肌肉瘤和胚胎性橫紋肌肉瘤組織均表達TGF-β1，TGF-βⅠ型、Ⅱ型受體和下游Smad分子；RD細胞可以自分泌TGF-β1，表達TGF-βⅠ型、Ⅱ型受體及下游分子Smads，并證實TGF-β/Smad信號通路存在于RD細胞中。為研究TGF-β/Smad信號對RD細胞生長和凋亡的調(diào)控作

4、用及其機制，我們采用小分子RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，特異性封閉TGF-β/Smad信號通路上中樞性傳遞因子Smad4的表達以阻礙信號的轉(zhuǎn)導；并給以外源性、較高濃度TGF-β1刺激細胞，分別檢測內(nèi)源性和外源性TGF-β/Smad信號對RD細胞生長、凋亡的調(diào)控。并對TGF-β/Smad信號在調(diào)控RD細胞生長的分子機制上作深入研究。獲如下主要結(jié)果： 1.以陽離子脂質(zhì)體為載體，將生物合成的shRNA(s

5、horthairpinRNA，shRNA)轉(zhuǎn)入RD細胞。采用RT-PCR和Westernblot檢驗shRNA對Smad4的封閉效果，5條shRNA鏈中，Y1鏈具有最佳干擾效果，自轉(zhuǎn)入細胞12小時起，在96小時內(nèi)可有效發(fā)揮封閉RD細胞中Smad4mRNA和蛋白表達的作用；采用免疫熒光化學，通過激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)：TGF-β1刺激經(jīng)shRNA干擾的RD細胞，胞質(zhì)中的Smad2/3入核明顯減少，該信號轉(zhuǎn)導受阻。提示：RNAi技術(shù)可有效

6、封閉Smad4的表達；Smad4表達的抑制可以在一定程度上阻斷TGF-β/Smad信號在RD細胞中的轉(zhuǎn)導。 2.應(yīng)用3H-thymidine摻入實驗和MTT實驗檢測內(nèi)源性TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導受阻或外源性TGF-β1刺激對RD細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)RNA干擾組，RNA干擾加TGF-β1刺激組及TGF-β1刺激組，細胞生長活力均低于正常對照組，并隨培養(yǎng)時間的延長而下降。采用流式細胞術(shù)檢測TGF-β/Smad信號對RD細胞周期的

7、影響，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導受阻和外源性的TGF-β1刺激均可導致RD細胞周期出現(xiàn)G1期的停滯。通過電鏡檢測以及激光共聚焦顯微鏡對細胞Dapi染色的觀測，均發(fā)現(xiàn)RNA干擾組和RNA干擾加TGF-β1組有明顯的凋亡小體形成。在分子水平上，流式細胞術(shù)和DNA片段檢測也證實在RNA干擾組和RNA干擾加TGF-β1組細胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。提示：通過RNAi技術(shù)使TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導受阻導致RD細胞生長抑制，并誘導細胞

8、凋亡；外源性、較高濃度的TGF-β1可以抑制RD細胞的生長，但并不誘導凋亡。 3.RT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)：TGF-β1在mRNA和蛋白水平上調(diào)P27、P21，下調(diào)C-myc的表達。而對P15，CDK2和CDK4的表達無明顯影響。免疫共沉淀和體外激酶實驗檢測，發(fā)現(xiàn)TGF-β1上調(diào)P27的表達促使結(jié)合到CyclinE-cdk2復合體上的P27增加，從而抑制CDK2的磷酸化激酶活性。而與CyclinD-cdk4，

9、CyclinE-cdk2復合體結(jié)合的P21蛋白無明顯增加。CDK4的磷酸化激酶活性也未受到明顯抑制。另外，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示：TGF-β1可促使RD細胞中P27出現(xiàn)伴隨熒光強度增加的核周聚集現(xiàn)象。TGF-β1刺激還可導致胞核表達的P21彌散到胞質(zhì)。 以上研究結(jié)果提示，在生理濃度下，TGF-β1/Smad信號是維持RD細胞生長所必需。阻礙內(nèi)源性TGF-β1/Smad信號的轉(zhuǎn)導不但抑制細胞生長，還能誘導細胞凋亡。外源性、較