Smad對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)影響機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分、 HDM刺激小鼠肺SMAD蛋白表達(dá)
　　 目的：探討屋塵螨（HDM）氣道刺激后，不同遺傳背景小鼠肺組織SMAD蛋白表達(dá)有何不同。
　　 方法：將A/J和C3H小鼠分別用HDM氣道刺激，在最后一次刺激16小時(shí)后，取肺組織，經(jīng)過(guò)勻漿處理，提取核蛋白，用western blot免疫印跡法檢測(cè)肺組織蛋白中Smad2/3、Smad6的表達(dá)。
　　 結(jié)果：A/J和C3H小鼠在HDM氣道刺激16小時(shí)后，肺組織Smad

2、6蛋白表達(dá)差異明顯，表現(xiàn)為A/J小鼠Smad6升高，而C3H則呈現(xiàn)于A/J相反得變化，Smad6表達(dá)降低，而Smad2/3表達(dá)則正好相反，A/J降低，C3H增高。
　　 結(jié)論：經(jīng)HDM氣道刺激后，不同遺傳背景小鼠Smad表達(dá)有所差異，需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證其在TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。
　　 第二部分、針對(duì)小鼠Smad6基因的RNA干擾
　　 目的：針對(duì)目的基因Smad6 CDS區(qū)設(shè)計(jì)siRNA序列，構(gòu)建表達(dá)載體，

3、探討感染后BMDC細(xì)胞中Smad6基因和蛋白表達(dá)狀況。
　　 方法：針對(duì)目的基因Smad6 CDS區(qū)設(shè)計(jì)三條siRNA序列，分別為siRNA1、siRNA2、siRNA3，使用siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector進(jìn)行siRNA表達(dá)載體構(gòu)建，對(duì)構(gòu)建成功的siRNA重組表達(dá)載體進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA抽提，siRNA重組表達(dá)載體DNA轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，然后Real-time PCR的方法檢測(cè)基

4、因干預(yù)后L929細(xì)胞中Smad6基因表達(dá)狀況，使用Lentivirus Pakagesysterm進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝和生產(chǎn)，測(cè)定病毒滴度（梯度稀釋法），再分離C3H/HeJ小鼠骨髓原代BMDC，獲取最佳MOI值以及感染條件，后用慢病毒感染BMDC細(xì)胞，RT-PCR和western blot分別檢測(cè)感染后細(xì)胞中Smad6基因的表達(dá)及SMAD6蛋白表達(dá)狀況。
　　 結(jié)果：Real Time-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA1對(duì)于Sm

5、ad6基因的沉默效果最好，沉默效率約為67％。考慮到細(xì)胞大約75％的轉(zhuǎn)染效率，實(shí)際的基因沉默可能達(dá)到90％（mRNA），最佳MOI值為20，RealTime-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，通過(guò)病毒載體感染BMDC細(xì)胞，提示siRNA1對(duì)于Smad6基因的沉默效約為85％，而B(niǎo)MDC中蛋白表達(dá)被明顯抑制，與對(duì)照組有差異有顯著性。
　　 結(jié)論：我們針對(duì)目的基因Smad6 CDS區(qū)所設(shè)計(jì)的siRNA序列而構(gòu)建的表達(dá)載體能成功有效抑制Smad6基