MOO促成肌細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化對TGF-β2信號傳導(dǎo)的影響.pdf

1、研究背景和目的:目前,人們正在探索的細(xì)胞移植技術(shù),為急性心肌梗死(acute myocardialinfarction,AMI)患者壞死區(qū)的心肌細(xì)胞重建及衰竭心臟的功能恢復(fù),提供了一種全新的治療策略。研究表明,以正常的肌細(xì)胞取代疤痕組織,改善心肌梗死的預(yù)后及預(yù)防心衰的發(fā)生發(fā)展,可能是一種極具前途的臨床治療手段。存在于骨骼肌的質(zhì)膜與基底膜之間的成肌細(xì)胞(myoblast)作為肌組織前體細(xì)胞,具有定向分化為骨骼肌或心肌細(xì)胞的潛力。本導(dǎo)師組近

2、年來一直致力于巴戟天寡糖(Morindaofficinalis How oligosaccharides,MOO)保護(hù)心臟作用的研究,前期的研究初步證實(shí)MOO具有明顯促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖和分化的作用,可在一定劑量范圍內(nèi)增加成肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-betal,TGF-β1)的表達(dá)。但對TGF-β2受體及其信號傳導(dǎo)的影響尚屬空白。因此,本課題在前期工作的研究基礎(chǔ)上,采用離體純化培養(yǎng)乳鼠

3、雙側(cè)后肢骨骼肌成肌細(xì)胞的方法及免疫細(xì)胞化學(xué)、蛋白免疫痕跡技術(shù)來進(jìn)一步觀察巴戟天寡糖促成肌細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化時對TGF-β2受體及信號傳導(dǎo)的影響。
　　材料與方法:1.成肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)出生1~3d的SD大鼠乳鼠,無菌條件下剪取四肢骨骼肌,用0.05％Ⅱ型膠原酶和0.125％胰蛋白酶消化,收集成肌細(xì)胞懸液,差速貼壁法純化后制成濃度為3×10~5/ml的細(xì)胞懸液,接種到100ml培養(yǎng)瓶或6孔板中培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)48h后的原代成肌

4、細(xì)胞。2.藥物及分組MOO由河南大學(xué)藥學(xué)院協(xié)助制備。實(shí)驗(yàn)分6組:(1)空白對照組;(2)5-氮雜2’-脫氧胞苷[5-Aza-2’-deoxycytidine][5-Aza-dc](4μmol/ml)陽性藥對照組;(3)MOO大劑量(500μg/ml)組;(4)MOO中劑量(300μg/ml)組;(5)MOO小劑量(100μg/ml)組;(6)MOO中劑量+5-Aza-dc組。3.觀察指標(biāo)分別觀察以下指標(biāo):(1)成肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變及成肌

5、細(xì)胞的鑒定。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)測定TGF-β2、Smad4。(3)Western Blotting測定磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)、Smad7。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS11.0。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示。組間比較采用單因素方差分析。當(dāng)差異有顯著意義時進(jìn)一步用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。多個實(shí)驗(yàn)組與一個對照組比較用最小顯著差法(LSD)。檢驗(yàn)結(jié)果均取a=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1.成肌細(xì)

6、胞的形態(tài)學(xué)改變原代培養(yǎng)1~2天的成肌細(xì)胞呈梭形或紡錘形,具有較好的折光性;第3天成肌細(xì)胞生長迅速,表現(xiàn)出很強(qiáng)的分裂增殖能力:第4~5天大量增殖的成肌細(xì)胞變得細(xì)長,形成多核性長管狀初生肌管,分化狀態(tài)較好的肌管有自發(fā)性搏動的收縮現(xiàn)象;第6天初生肌管有相互融合的趨勢。隨后,肌管數(shù)量增多,并見長管狀的成肌細(xì)胞互相連接成網(wǎng)狀,出現(xiàn)“節(jié)律性收縮”現(xiàn)象。細(xì)胞收縮頻率受溫度等影響較明顯,溫度低時收縮頻率明顯減慢。2.Desmin鑒定對4~5天的成肌細(xì)胞

7、用desmin抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色,結(jié)果胞漿呈陽性反應(yīng),表明培養(yǎng)的細(xì)胞為成肌細(xì)胞。3.MOO對TGF-β2蛋白表達(dá)的影響免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:與空白對照組相比,各組TGF-β2表達(dá)水平均上調(diào),差異顯著(P<0.05),MOO隨劑量增加表達(dá)增強(qiáng);與陽性對照組相比,MOO屑亮孔門GF-β2表達(dá)水平?jīng)]有上調(diào),其余各組表達(dá)水平上調(diào),差異顯著(P<0.05);與聯(lián)合組相比,陽性組TGF-β2表達(dá)水平不及聯(lián)合組,差異顯著(P<0.05),MOO

8、中劑量組TGF-β2表達(dá)水平和聯(lián)合組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.MOO對Smad4蛋白表達(dá)的影響免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:與空白對照組相比,各組Smad4表達(dá)水平均上調(diào),差異顯著(P<0.05);與陽性組對照組相比,各組Smad4表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與聯(lián)合組相比,各組Smad4表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.MOO對p-Smad2/3蛋白表達(dá)的影響Western Blotting結(jié)果顯示:與空白對照組相比,MOO小劑量組p-Smad2/3表達(dá)輕微上調(diào),M

9、OO隨劑量增加,下調(diào)增強(qiáng),其中,MOO大劑量下調(diào)p-Smad2/3表達(dá),差異顯著(P<0.05),陽性組下調(diào)p-Smad2/3表達(dá),差異顯著(P<0.05),聯(lián)合組輕微上調(diào)p-Smad2/3表達(dá);與陽性組對照組相比,MOO小劑量組、聯(lián)合組p-Smad2/3表達(dá)上調(diào),差異顯著(P<0.05),MOO大劑量組p-Smad2/3表達(dá)下調(diào),MOO中劑量組p-Smad2/3表達(dá)與其幾乎相同。與聯(lián)合組相比,陽性組、MOO中劑量組p-Smad2/3表

10、達(dá)不及聯(lián)合組,差異顯著(P<0.05)。6.MOO對Smad7蛋白表達(dá)的影響Western Blotting結(jié)果顯示:與空白對照組相比,各組Smad7的表達(dá)差異顯著(P<0.05),其中,MOO小劑量組Smad7的表達(dá)受抑制,隨劑量的增加,表達(dá)逐漸增強(qiáng),陽性組和聯(lián)合組下調(diào)Smad7的表達(dá);與陽性組對照組相比,MOO小劑量組、大劑量組Smad7表達(dá)差異顯著(P<0.05),其中,MOO大劑量組上調(diào)Smad7表達(dá),MOO小劑量組抑制Smad

11、7表達(dá);與聯(lián)合組相比,MOO中劑量組和陽性組Smad7表達(dá)無差異,MOO小劑量組、大劑量組Smad7表達(dá)差異顯著(P<0.05),其中,MOO大劑量組上調(diào)Smad7表達(dá),MOO小劑量組抑制Smad7表達(dá)。
　　結(jié)論:1.巴戟天寡糖可劑量依賴性的促進(jìn)成肌細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化時TGF-β2的表達(dá)。2.巴戟天寡糖對成肌細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化過程中TGF-β2下游信號傳導(dǎo)因子Smads表達(dá)的影響:顯著上調(diào)Smad4的表達(dá);不同劑量對p-Sm