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文檔簡介
1、本文利用TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)對RD細胞進行分化誘導(dǎo),并對其分化機制以及分化過程中早期分化標志一生肌蛋白基因啟動子區(qū)染色質(zhì)的重塑以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的結(jié)合進行研究,為橫紋肌肉瘤的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。 染色質(zhì)修飾酶通過對染色質(zhì)的修飾,對染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行調(diào)整,促進或阻遏轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合,從而對基因的轉(zhuǎn)錄起激活或抑制作用。染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin Imu
2、noprecipitation,ChiP)分析是近些年發(fā)展起來檢測蛋白因子在體內(nèi)與染色質(zhì)的結(jié)合,進而為蛋白因子參與染色質(zhì)水平基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供證據(jù)的方法。本研究運用該方法,檢測了TPA誘導(dǎo)的RD細胞分化過程中,肌細胞分化決定因子MyoD、染色質(zhì)重塑復(fù)合體SWI/SNF催化亞基BRGl、乙酰轉(zhuǎn)移酶p300和p300/CBP相關(guān)因子PCAF與生肌蛋白基因啟動子區(qū)染色質(zhì)的結(jié)合情況。并應(yīng)用質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染及競爭性RT-PeR的方法進一步研究了PKC
3、、p38、PCAF、p300以及BRGl對生肌蛋白基因啟動子活性的影響。 一、RD細胞分化過程中的相關(guān)信號途徑。 RD細胞,主要呈圓形和多邊形,少數(shù)紡錘形;而TPA誘導(dǎo)處理后,RD細胞逐漸呈現(xiàn)典型的分化形態(tài),如胞體伸長,細胞內(nèi)顆粒物增多,出現(xiàn)多核肌纖維類似結(jié)構(gòu)等(圖1)。與對照相比,TPA誘導(dǎo)分化的RD細胞,其生肌蛋白(骨骼肌早期分化標心=kz)和肌球蛋白重鏈(Myosin Heavy Chain,骨骼肌晚期分化標志)的
4、mRNA水平隨TPA作用時間的增加而增加(圖2);而且生肌蛋白蛋白水平在24 h后表現(xiàn)明顯的升高,而肌球蛋白重鏈蛋白水平在TPA誘導(dǎo)48h后也表現(xiàn)明顯的增強(圖3)。提示TPA的誘導(dǎo)處理可能激活了生肌蛋白的完全表達,從而指導(dǎo)RD細胞重新進入并完成分化。PKC抑制劑GF109203X的處理可抑制TPA誘導(dǎo)的RD細胞生肌蛋白和肌球蛋白重鏈的蛋白表達量的升高(圖4);p38抑制劑SB203580的處理,也可明顯抑制TPA誘導(dǎo)的RD細胞分化過程
5、中生肌蛋白和肌球蛋白重鏈蛋白表達的增加以及mRNA水平的升高(圖5,6)。提示PKC與p38是TPA誘導(dǎo)的RD細胞分化的必經(jīng)途徑。 二、RD細胞分化過程中染色質(zhì)調(diào)整蛋白及修飾因子與生肌蛋白基因啟動子的結(jié)合分析。TPA能誘導(dǎo)RD細胞分化,表明RD細胞中存在行使SWI/SNF復(fù)合物功能所需的輔助因子。我們發(fā)現(xiàn),橫紋肌肉瘤RD細胞僅表達染色質(zhì)重塑復(fù)合物SWI/SNF的ATPase催化亞基BRGl,而不表達BRM(圖7)。 Ch
6、IP實驗結(jié)果表明(圖8),(1)未經(jīng)TPA誘導(dǎo)的對照RD細胞中,MyoD、p300均可結(jié)合到生肌蛋白基因啟動子,而PCAF與BRG1在對照RD細胞中并不與生肌蛋白基因啟動子結(jié)合。(2)在TPA誘導(dǎo)RD細胞分化6h后,PCAF開始結(jié)合于生肌蛋白基因啟動子,而誘導(dǎo)12h后,BRG1開始與生肌蛋白基因啟動子結(jié)合。p38抑制劑SB203580的處理,抑制BRG1與生肌蛋白基因啟動子的結(jié)合,卻并不影響MyoD,D300以及TPA誘導(dǎo)的PCAF與生
7、肌蛋白基因啟動子的結(jié)合。(3)RD細胞中MyoD呈非乙酰化狀態(tài),在TPA誘導(dǎo)分化6h后MyoD開始被乙?;?圖9)。 三、RD細胞分化過程中染色質(zhì)調(diào)整蛋白及修飾因子對生肌蛋白基因啟動子活性的影響。 (1)將含有報告基因表達質(zhì)粒pREP4m-myog-CAT和轉(zhuǎn)染內(nèi)參照質(zhì)粒pM-CAT瞬時共轉(zhuǎn)染RD細胞之后加入TPA進行誘導(dǎo)處理,啟動子活性分析結(jié)果表明,TPA可以增強生肌蛋白基因的啟動子活性,而SB203580的處理則抑制
8、TPA對生肌蛋白基因的誘導(dǎo)增強效應(yīng)(圖14),進一步證實了p38是TPA激活生肌蛋白基因表達的必經(jīng)環(huán)節(jié)。 (2)PKCα表達質(zhì)?;騪38表達質(zhì)粒pREP4m-myog-CAT和pM-CAT瞬時共轉(zhuǎn)染RD細胞,啟動子活性分析結(jié)果表明,PKCα可以增強生肌蛋白基因的啟動子活性,但p38對其無效應(yīng)(圖15),提示p38對生肌蛋白基因表達的激活還需要其它因子的參與。 (3)PCAF表達質(zhì)?;騪300表達質(zhì)粒與pREP4m-myo
9、g-CAT和pM-CAT瞬時共轉(zhuǎn)染RD細胞,啟動子活性分析結(jié)果表明,PCAF可以增強生肌蛋白啟動子的活性,但p300對生肌蛋白啟動子無影響(圖16)。PCAF與p38(或其顯性負突變體)表達質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明,DN-p38抑制PCAF對生肌蛋白啟動子活性的激活(IN 17),表明PCAF在調(diào)節(jié)生肌蛋白基因的表達中可能依賴于p38的活性。轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果還表明TSA的處理可以促進生肌蛋白基因的啟動子活性(圖18)。 (4)BRG
10、1表達質(zhì)粒(或其顯性負突變體)與pREP4m-myog-CAT和pM-CAT瞬時共轉(zhuǎn)染RD細胞后,進行TPA誘導(dǎo),啟動子活性分析結(jié)果表明,BRG1不影響生肌蛋白基因的啟動子活性,但能促進TPA誘導(dǎo)的生肌蛋白基因啟動子活性的增強,而DN-BRG1則抑制TPA對生肌蛋白基因啟動子活性的激活作用(圖19)。共轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果還表明,DN-BRG1也抑制PKCα和 PCAF對生肌蛋白基因啟動子活性的增強(圖20,21)。這些結(jié)果均表明BRG1對于生
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