乳腺癌患者腋窩前哨淋巴結CK19、MG的PCR檢測——腋窩分期的快速輔助診斷方法及其價值研究.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌患者腋窩淋巴結的轉移情況，直接影響著乳腺癌患者的10年復發(fā)率及生存率，所以腋窩淋巴結的轉移情況是一個重要的預后判斷指1。而前哨淋巴結(sentinel lymph node)，作為第一個接收原發(fā)乳腺癌區(qū)域淋巴引流的淋巴結2，其狀態(tài)可以準確反映腋窩淋巴結是否出現(xiàn)淋巴結轉移3。
　　 前哨淋巴結活檢與腋窩淋巴結清掃對比，前哨淋巴結狀態(tài)可判斷腋窩分期。前哨淋巴結的病理檢查效能已經(jīng)提高，更多的淋巴結微小轉

2、移灶(MICmicrometastases＞0.2mm to2mm)及孤立腫瘤細胞(ITC Isolated Tumor Cell≤0.2mm)可以被檢出。Reed J等人4對進行過前哨淋巴結活檢的的病人10年的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，MIC與病人的非前哨淋巴結陽性和遠處轉移是有相關性的，而ITC則沒有相關性。ITC在最新病理學分類中歸于淋巴結陰性，MIC則定義為淋巴結陽性5。所以前哨淋巴結檢測為MIC的病人，需要積極的乳腺癌術后輔助治療4。

3、所以快速輔助珍斷淋巴結大于0.2mm的前哨淋巴結轉移，可以幫助外科醫(yī)生判斷患者腋窩分期，從而決定手術方式，及后續(xù)輔助治療。
　　 我中心乳腺癌病的保乳包腋窩手術在國內處于領先水平，有近50％的病人采用保乳手術及前哨淋巴結活檢進行治療。在術中將腫物，腫物殘腔邊緣及SLN送術中冰凍活檢，根據(jù)腫物邊緣情況及SLN情況決定是否進行乳腺痛改良根治術及腋窩淋巴結清掃術。SLN術中冰凍，一般取淋巴結最大徑切片，行HE染色鏡檢。Takei H等

4、7在隊列研究中發(fā)現(xiàn)，術中冰凍的假陰性率為11.7％。現(xiàn)有的冰凍切片技術，因為敏感性低，在活檢過程中，往往可以導致50％的淋巴結組織丟8，術中冰凍出現(xiàn)假陰性，術后病理若為陽性時，會導致二次手術以及醫(yī)療費用增高，同時也增加了患者的精神壓力及經(jīng)濟負擔。因此，我們需要一個更可靠的檢驗方式，作為術中冰凍的輔助參考指標，減小術中冰凍假陰性率，提高SLNB的陽性檢出率，以減少二次手術率。
　　 隨著科學和技術的發(fā)展，采用對細胞特異的信使RNA

5、逆轉錄后進行擴增的實時定量逆轉錄聚合酶鏈技術(Q-RT-PCR)，我們可以提高腫瘤基因的檢測的敏感性。理想的乳腺腫瘤標記物應為特異性、敏感性高，同時為前哨淋巴結中并不表達的基因。
　　 該實驗檢測CK19及MG作為淋巴結陽性的腫瘤標汜物，以淋巴結的病理連續(xù)切片為金標準，檢測淋巴結轉移灶＞0.2mm(MIC)的敏感性和特異性，及其陽性預測值和陰性預測值。PBGD(Porphobilinogendeaminase，膽色素原脫氨酶)作

6、為前哨淋巴結的看家基因，選為該試驗的內部質控。
　　 研究目的：
　　 本試驗的主要目的是評價CK19和MG的PCR檢測，在判斷乳腺癌患者腋窩前哨淋巴結狀態(tài)的敏感性和特異性。
　　 本試驗的次要目的是評CK19和MG用于乳腺癌患者腋窩前哨淋巴結狀態(tài)檢測的陽性預測值和陰性預測值。
　　 材料與方法：
　　 一、樣本資料
　　 入組條件：1、確珍乳癌病人并計劃手術進行SLNB者；2、年齡≥18

7、歲，男性或女性；3、簽署臨床實驗知情同意書者(OCD-200804)
　　 排出條件：1、患者已參加其他臨床實驗研究；2、同側已進行過前哨淋巴結活檢術；3、不符合邏輯病例：例如手術時間到淋巴結勻漿時間大于45分鐘。
　　 本實驗全部入組病人67例，排除13例，其中包括良性疾病3例，不符合邏輯病例10例。54例乳腺癌病例臨床資料數(shù)據(jù)如下：
　　 1、手術情況：54例病人保乳根治術36例，改良根治術17例，其他1例。

8、
　　 2、根據(jù)腫瘤分期：Stage08例，StageⅠ15例，StageⅡ22例，StageⅢ3例，外院切取活檢3例，未知3例。
　　 3、根據(jù)腫瘤病理：浸潤性導管癌37例，浸潤性小葉癌2例，原位癌8例，粘液癌2例，Paget's病Ⅰ例，髓樣癌1例，囊內乳頭狀癌1例，腺樣囊狀癌1例，實性神經(jīng)內分泌癌1例。
　　 二、實驗方法
　　 1、實驗試劑：GeneSearch TM BLN Test Kit，由兩

9、部分試劑盒組成，分別為淋巴結準備試劑盒(GeneSearch TM RNA Samp1e Preparation Kit)和乳腺癌淋巴結試劑盒(GeneSearch TM BLN Kit)
　　 2、取材方法：取患者藍染前哨淋巴結送病理室，將淋巴結按要求切成偶數(shù)塊，將奇數(shù)塊送Q-RT-PCR檢驗，偶數(shù)塊送病理組織學檢驗。
　　 3、對CK19及MG進行實時逆轉錄聚合酶鏈式反應，使用CepheidSmartCyc1er(R

10、)系統(tǒng)產(chǎn)生目標基因的表達數(shù)據(jù)。然后根據(jù)預先確定的標準，提供定性結果?？煽焖贆z測前哨淋巴結大于0.2mm的轉移灶。
　　 4、以病理學檢驗結果為金標準，對比淋巴結Q-RT-PCR結果，評價CK19及MG作為乳腺癌患者腋窩前哨淋巴結狀態(tài)快速輔助檢測指標的敏感性和特異性，以及陽性預測值和陰性預測值。
　　 三、病理診斷標準：
　　 病理學診斷為金標準。病理學陽性是指前哨淋巴結的病理切片中癌轉移灶＞0.2mm
　　

11、 四、統(tǒng)計方法
　　 1、采用以下標準公式計算CK19和MG的敏感性和特異性：敏感性=(真陽性/(真陽性+假陰性))*100％特異性=(真陰性/(真陰性+假陽性))*100％
　　 2、采用以下標準公式計算CK19和MG的陽性預測價值和陰性預測價值：陽性預測價值=真陽性/(真陽性+假陽性)*100％陰性預測價值=真陰旺/(真陰性+假陰性)*100％
　　 3、靈敏性、特異性、陽性預測價值和陰性預測價值的95％胃

12、信區(qū)間的估計將根據(jù)二項分布進行計算。95％CI p-1.96(p(1-p)/n)-2 p+1.96(p(1-p)/n)-2
　　 結果：
　　 1 CK19及MG作為腫瘤標記物行PCR擴增，與病理金標準比較：敏感度：90.91％95％CI：[0.90,0.92]特異性：94.03％95％CI：[0.93,0.95]陽性預測價值71.43％95％CI[0.69,0.73]陰性預測價值98.44％95％CI：[0.98,0.

13、99]卡方檢驗：P=0.375＞0.05 PCR及連續(xù)病理切片無明顯差異
　　 2本中心病理及冰凍病理結果一致。符合率：96％ Kappa=1
　　 結論：
　　 CK19及MG作為腫瘤標汜物行PCR擴增，與病理金標準比較敏感性和特異性分別為90.91％和94.03％，陽性預測值和陰性預測值是71.43％和98.44％。PCR擴增CK19及MG可以成為病理檢查的一種快速輔助檢測手段，與病理結果相比，假陽性率高。是