Caspase-3抑制劑早期干預(yù)對(duì)小鼠膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)是危重患者常見的臨床并發(fā)癥之一，其危害大，病死率高(50％～70％)，可作為一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素影響患者預(yù)后。AKI的病因是多因素的，但由膿毒癥(sepsis)引起者可占50％以上。有研究表明膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的院內(nèi)病死率可高達(dá)70.2％?；仡欉^去20年，盡管在治療和研究技術(shù)方面取得了許多進(jìn)步，但是對(duì)于膿毒癥相關(guān)AKI患者的預(yù)后沒有實(shí)質(zhì)性改變，其病死率仍在不斷增長(zhǎng)!原因可能

2、與我們對(duì)膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制了解不夠，同時(shí)缺乏早期直觀的生物學(xué)標(biāo)志物及有效的治療措施相關(guān)。因此探討膿毒癥性腎損傷的病理生理學(xué)機(jī)制已成為一熱門話題。
　　 近年來一些人提出細(xì)胞凋亡在急性腎損傷中起重要作用，并有研究證明，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase酶)的廣譜抑制劑或特異性拮抗劑能夠改善缺血再灌注及中毒性腎損傷。在膿毒癥相關(guān)AKI中，也有人研究發(fā)現(xiàn)其腎組織損傷以細(xì)胞凋亡為主，但這一觀點(diǎn)也被許多人所質(zhì)疑。因此

3、凋亡在膿毒癥相關(guān)急性腎損傷中是否起著關(guān)鍵作用還存在爭(zhēng)議。
　　 凋亡可由多種應(yīng)激原如炎癥因子、缺血、氧化應(yīng)激、紫外線等誘因作用下觸發(fā)。Caspase酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)在凋亡復(fù)雜過程的大多調(diào)制因子中，居于核心地位。而caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族(caspase家族)中關(guān)鍵酶之一，通常以無活性的酶原形式存在?；罨蟮腸aspase-3可使細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞骨架的重要蛋白質(zhì)降解失活。Ac-DEVD-CHO是一種人工合成的非生物性抑

4、制劑，能竟?fàn)幮耘ccaspase-3結(jié)合阻斷caspase-3對(duì)底物蛋白質(zhì)的降解作用，從而抑制caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，起到器官保護(hù)作用。
　　 本研究旨在采用盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture，CLP)法復(fù)制膿毒癥相關(guān)急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)模型，應(yīng)用免疫組化法(immunohistochemisty)、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM

5、)等方法檢測(cè)凋亡抑制劑Ac-DEVD-CHO對(duì)腎組織凋亡相關(guān)因子caspase-3、Bcl-2、Bax等蛋白表達(dá)的影響，探討caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO對(duì)膿毒癥急性腎損傷小鼠的腎保護(hù)性作用，并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　 方法：本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture，CLP)法復(fù)制小鼠膿毒癥致AKI模型。健康清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠72只，隨機(jī)分為3組(n=24)

6、，①假手術(shù)組(sham group):只開腹，翻動(dòng)腸管，牽拉盲腸后關(guān)腹，不結(jié)扎和穿孔盲腸；②盲腸結(jié)扎穿孔組(CLP group):進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)；③Caspase-3抑制劑早期干預(yù)組(Caspase-3 inhibitor group):先進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，術(shù)后30min立即給予4μg/g Ac-DEVD-CHO凋亡抑制劑溶于1％DMSO液中，腹部皮下注射。各組術(shù)后均給予37℃“生理鹽水”30ml/kg股部皮下注射，并于術(shù)后3小時(shí)

7、給予“亞胺培南西司他丁鈉”25mg/kg，腹部皮下注射一次，然后以相同劑量Q12hr×2天。三組分別在術(shù)后6h、12h、24h后通過摘眼球法采血（每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各8只），各組取血標(biāo)本離心后取血清于-80℃凍存，用于測(cè)定血清中的肌酐、尿素氮水平。同時(shí)取腎臟分為三部分，1/2左腎放入10％中性福爾馬林中固定24至48小時(shí)后石蠟包被，用于光鏡檢測(cè)及病理損傷評(píng)分；另外1/2左腎放入4％多聚甲醛中固定24至48小時(shí)后石蠟包被，用于免疫組化法檢測(cè)c

8、aspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及定位；右腎放入70％的乙醇中固定24至48小時(shí)，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡率以及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。
　　 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0版軟件包(SPSS Company，Chicago，Illinois，USA)進(jìn)行；數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，多

9、個(gè)均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或S-N-K檢驗(yàn)，方差不齊用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換和Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況和腎臟大體形態(tài)的觀察Sham組小鼠術(shù)后很快清醒且活動(dòng)靈活；可自由飲水、進(jìn)食；皮毛順滑，雙眼分泌物少或無；剖腹可見腹腔結(jié)構(gòu)清晰，無異常腹水及惡臭味，腸管表面光滑濕潤(rùn)。CLP組小鼠術(shù)后蘇醒延遲且精神萎靡，活動(dòng)遲緩；進(jìn)食較少；豎毛明顯，雙眼分泌物較

10、多。剖腹可見淡血性腹水量多，有惡臭；腸管水腫充血，腹腔腸管結(jié)構(gòu)不清，組織粘連，部分盲腸末端發(fā)黑。CI組小鼠術(shù)后一般情況介于前兩者之間。
　　 Sham組腎臟顏色紅潤(rùn)，色澤較暗；CLP組腎臟水腫充血明顯，色澤鮮紅；CI組腎臟略水腫，充血較CLP組不明顯，色澤介于前兩者之間。
　　 2.組織病理變化(HE染色)及腎臟組織損傷病理評(píng)分結(jié)果腎臟組織病理變化(HE染色)：sham組：光鏡下腎組織形態(tài)基本正常；CLP組：腎小球及腎小

11、管明顯充血，腎小管上皮細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)可見明顯空泡變性和玻璃樣變性，并伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；CI組：腎小管上皮細(xì)胞損傷較CLP組明顯減輕，少量細(xì)胞出現(xiàn)輕微腫脹、脫落及空泡變性，腎小管形狀保持較好。
　　 腎臟組織損傷病理評(píng)分結(jié)果：術(shù)后6hCLP組病理損傷評(píng)分明顯高于sham組及CI組(P＜0.01），而后兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05)；術(shù)后12h、24h均有相似結(jié)果（P＜0.05）。sham組、CLP組、CI組各組內(nèi)病理損傷評(píng)

12、分隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 3.各組小鼠腎功能血清Cr及BUN結(jié)果術(shù)后6hCr值CLP組較sham組明顯升高(P＜0.01);CI組明顯降低了CLP組升高的Cr值(P＜0.01)，與Sham組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。術(shù)后12h及24hsham組、CLP組和CI組三組任意兩者Cr值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 Sham組與CLP組Cr在術(shù)后6h、12h、24h隨時(shí)間呈下

13、降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。CI組Cr值術(shù)后隨時(shí)間也呈下降趨勢(shì)，且術(shù)后24h較6h下降明顯(P＜0.05）。
　　 術(shù)后6hBUN值CLP組較sham組明顯升高(P＜0.05);CI組明顯降低了CLP組升高的BUN值（P＜0.05），與Sham組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。術(shù)后12hCLP組BUN值較sham組升高（P＜0.05），其余任意兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。術(shù)后24hBUN值任意兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、差異(P＞0.05）。Sham組內(nèi)BUN在術(shù)后6h、12h、24h隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。CLP組BUN在術(shù)后12h較6h、24h增高，但三者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。CI組與CLP組有相似結(jié)果。
　　 4.各組腎組織細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果術(shù)后6h腎小管上皮細(xì)胞凋亡率CLP組較sham組明顯升高(P＜0.01)，CI組明顯降低了CLP升高的細(xì)胞凋亡率(P＜0.01)，與sham組相比也顯著升高(P＜0.

15、01)。術(shù)后12h及24h有相似結(jié)果。
　　 Sham組內(nèi)腎小管上皮細(xì)胞凋亡率在術(shù)后6h、12h、24h隨時(shí)間有下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);CLP組隨時(shí)間也呈下降趨勢(shì)，且24h與6h相比明顯下降(P＜0.01);CI組隨時(shí)間呈明顯下降趨勢(shì)，且任意兩組間有顯著差異(P＜0.01)。
　　 5.各組凋亡相關(guān)因子腎組織Bcl-2及Bax檢測(cè)結(jié)果術(shù)后6hBcl-2蛋白表達(dá)在CLP組、CI組均較sham組有增高趨勢(shì)，

16、但無明顯差異（P＞0.05）；而術(shù)后12h、24h三者Bcl-2蛋白表達(dá)CLP組較sham組明顯增高(P＜0.01)，而CI組在CLP增高的基礎(chǔ)上又明顯增高(P＜0.01)。
　　 Sham組內(nèi)Bcl-2在術(shù)后6h、12h、24h無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。CLP組內(nèi)Bcl-2在術(shù)后12h、24h較6h蛋白表達(dá)增高(P＜0.01)，24h較12h無明顯差異(P＞0.05);CI組與CLP組有相似結(jié)果。
　　 術(shù)后6hB

17、ax蛋白表達(dá)CLP組較sham組呈增高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，CI組明顯降低了CLP組升高的Bax表達(dá)(P＜0.01）；12h、24hCLP組較sham組明顯增高(P＜0.01)，其余結(jié)果與6h相同。
　　 Sham組內(nèi)Bax在術(shù)后6h、12h、24h無明顯差異(P＞0.05);CLP組內(nèi)Bax在術(shù)后12h、24h較6h表達(dá)均明顯增高(P＜0.01)，24h較12h也明顯增高(P＜0.01);CI組與CLP組有相似

18、結(jié)果。
　　 6.各組免疫組化腎組織凋亡相關(guān)caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)結(jié)果Caspase-3蛋白術(shù)后24h陽性表達(dá)在sham組腎組織較少；而在CLP組胞漿中有較高表達(dá)，以腎小管細(xì)胞為主；CI組表達(dá)較CLP組明顯減少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而sham組與CI組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 Bcl-2蛋白術(shù)后24小時(shí)陽性表達(dá)在sham組腎組織甚微；而在CLP組胞漿中有較高表達(dá)，CI組

19、表達(dá)較CLP組明顯增高，三者呈遞增趨勢(shì)。且任意兩組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　 Bax蛋白術(shù)后24小時(shí)陽性表達(dá)在sham組腎組織較少；而在CLP組胞漿中有較高表達(dá)(P＜0.05），CI組表達(dá)較CLP組明顯降低(P＜0.05)，較sham組變化不明顯（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.凋亡是膿毒癥導(dǎo)致急性腎損傷的一個(gè)重要機(jī)制；
　　 2.Caspase-3作為凋亡途徑的關(guān)鍵酶在膿毒癥導(dǎo)