靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)Gαi2ctp基因去迷走神經(jīng)治療心房顫動的效果研究.pdf

1、目的:迷走神經(jīng)是心房纖顫（房顫）發(fā)生和維持的重要機(jī)制，去迷走神經(jīng)消融是房顫消融領(lǐng)域的熱點(diǎn)。雖然之前的研究表明能明顯提高房顫消融的成功率、提高了房顫治療率，但近期另一些研究不斷涌現(xiàn)表明此種手術(shù)方式并無益處甚至有害。考慮心臟迷走神經(jīng)末梢釋放突觸前遞質(zhì)乙酰膽堿，通過G-蛋白激活內(nèi)向整流鉀電流(IK-Ach)可誘發(fā)房顫。加之前期研究發(fā)現(xiàn)，利用超聲微泡技術(shù)轉(zhuǎn)Gαi2 C末端肽(Gαi2ctp)至犬心房可以干擾迷走神經(jīng)活性，減少迷走介導(dǎo)的房顫的發(fā)生

2、，但以肽段為基礎(chǔ)的藥物治療需要肽段在心房肌細(xì)胞內(nèi)持續(xù)而可控的表達(dá)，其應(yīng)用受到一定程度的制約。故本研究擬采用快速起搏建立的犬房顫模型，構(gòu)建表達(dá)Gαi2ctp基因的載體，通過開胸局部注射的方法靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)至犬心房，增加心房肌的表達(dá)量，干擾迷走神經(jīng)活性，減少迷走神經(jīng)介導(dǎo)的房顫的發(fā)生，并從電生理學(xué)、組織學(xué)、分子生物學(xué)等角度驗(yàn)證其療效，明確基因靶向干預(yù)治療的有效性及可行性，為房顫的基因治療提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1）構(gòu)建

3、Gαi2ctp重組腺病毒表達(dá)載體。利用293細(xì)胞包裝擴(kuò)增rAd-Gαi2ctp，獲得大量含Gαi2ctp的重組腺病毒;用PCR法鑒定擴(kuò)增的重組腺病毒;用熒光梯度稀釋方法測定重組腺病毒rAd-Gαi2ctp滴度。在乳鼠心肌細(xì)胞中觀察轉(zhuǎn)染后最佳表達(dá)時間;在犬心房肌中進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果以及觀察對肺、肝、腎的安全性;
　　2）實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為2組，經(jīng)典的快速心房起搏致急性房顫組（N=6只）:行左心耳快速起搏6小時。迷走介導(dǎo)型房顫組（N=7

4、只）:給予左心耳快速起搏術(shù)（RAP），同時加右側(cè)迷走神經(jīng)閾上刺激(VNS)6小時。測定兩組犬心房和肺靜脈各部位有效不應(yīng)期（ERP）變化、單相動作電位(MAP)變化、房顫誘發(fā)率;觀察心房組織HE染色變化、MASSON染色變化、糖原染色（PAS）變化，進(jìn)一步電鏡觀察心肌組織病理組織和超微結(jié)構(gòu)改變。免疫組化觀察心房神經(jīng)叢的代表右上神經(jīng)節(jié)叢(ARGP)中，酪氨酸羥化酶(TH)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)氨酶（CHAT）的變化，驗(yàn)證迷走介導(dǎo)型急性房顫模型的可實(shí)施

5、性;
　　3）實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為3組。①假手術(shù)組（A組，N=5只）:經(jīng)胸心房肌灃射500μl生理鹽水;②rAd-EGFP+房顫組（B組，N=6只）:經(jīng)胸心房肌內(nèi)注射500μl攜帶EGFP（綠色熒光蛋白）基因的重組腺病毒溶液。③rAd-Gαi2ctp+房顫組（C組，N=6只）:經(jīng)胸心房肌內(nèi)注射500μl攜帶Gαi2ctp基因的重組腺病毒溶液。三組均在7天后制作急性房顫模型。檢測三組犬在體左、右心房電生理指標(biāo)的變化;觀察三組犬左右心房離

6、體微電極陣列芯片(MEA)電傳導(dǎo)圖和場電位時程(FAPD)變化;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收取心房肌行HE染色、PAS染色檢測;取右上神經(jīng)節(jié)叢行免疫組化半定量檢測TH、CHAT的表達(dá);采用Western blot的方法測定心房和肺靜脈不同部位Gαi2ctp的蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況;證實(shí)Gαi2ctp對急性迷走神經(jīng)介導(dǎo)型房顫防治的效果;
　　4）實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為3組。①假手術(shù)+房顫組（A組，N=6只）:開胸關(guān)胸假手術(shù)，術(shù)后7天制作急性房顫模型;②rA

7、d-Gαi2ctp+房顫組（B組，N=7只）:經(jīng)胸心房肌內(nèi)注射500μl攜帶EGFP（綠色熒光蛋白）基因的重組腺病毒溶液7天后制作急性房顫模型;③去迷走神經(jīng)消融+房顫組（C組，N=6只）:去迷走神經(jīng)消融術(shù)后7天制作急性房顫模型。檢測犬心房肌組織電生理參數(shù)的改變。對比Gαi2ctp基因治療和經(jīng)典去迷走神經(jīng)消融手術(shù)對急性迷走神經(jīng)介導(dǎo)型房顫的效果。
　　結(jié)果:
　　1）293細(xì)胞包裝擴(kuò)增rAd-Gαi2ctp，獲得大量含Gαi2c

8、tp的腺病毒，擴(kuò)增后病毒滴度為1×1011 pfu/ml;在乳鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后最佳表達(dá)時間為5-7天，10天后逐漸消失;對犬經(jīng)胸心房肌注射rAd-Gαi2ctp基因轉(zhuǎn)染后，左、右心房冰凍切片均顯示大量綠色熒光蛋白表達(dá)，呈強(qiáng)陽性，主要臟器肺臟，肝臟，腎臟冰凍切片均顯示少量綠色熒光蛋白表達(dá)，呈弱陽性。肺肝腎親和性強(qiáng)，但表達(dá)較心肌少，安全性適中;
　　2)兩組房顫組在起搏1小時，3小時，6小時后ERP與基線水平相比，ERP明顯縮短;兩組

9、組間各時間點(diǎn)比較:RAP+VNS組與單純RAP組比較，ERP明顯縮短。兩組心房肌MAP隨時間延長，出現(xiàn)復(fù)極90％動作電位時程(APD90)縮短的明顯趨勢。兩組房顫誘發(fā)率以RAP+VNS組為最高，6小時急性房顫模型成功率達(dá)到100％。HE染色病理組織變化:兩組心房肌組織心肌細(xì)胞排列紊亂，拉長呈波紋狀;MASSON染色顯示兩組心肌纖維之間連接組織積聚，心肌細(xì)胞之間的間隔增寬;PAS染色顯示兩組糖原累積明顯，以RAP+VNS組為顯著。兩組心房

10、肌神經(jīng)叢RAP+VNS組TH、CHAT均表達(dá)多于RAP組;
　　3)三組兩兩比較，B組ERP和FAPD變化分別與A組和C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，A組和C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組組內(nèi)比較，A組假手術(shù)組和C組Gαi2ctp基因組每小時末電生理指標(biāo)和基線水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。B組空載基因房顫組每小時末電生理指標(biāo)和基線水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。觀察三組犬左右心房離體MEA電傳導(dǎo)圖變化:B組顯示傳導(dǎo)紊亂，A組和C組明顯傳導(dǎo)未見異

11、常。心房肌PAS染色發(fā)現(xiàn)三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。三組右上神經(jīng)節(jié)叢行免疫組化半定量檢測發(fā)現(xiàn)TH、CHAT的表達(dá)以B組為多;Western Blot檢測顯示犬心房Gαi2ctp表達(dá):三組犬心臟心房Gαi2ctp蛋白含量的比較發(fā)現(xiàn)，犬心房Gαi2ctp蛋白表達(dá)含量以rAd-Gαi2ctp+房顫組（C組）相對較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　4)3組肺靜脈和心房各部位ERP值比較:組A分別與組B和組C比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;各組組內(nèi)比較:A組

12、ERP在各時間段隨著時間的延長顯著縮短，與基礎(chǔ)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。B組和C組在起搏1小時、3小時、6小時與基線水平比較，ERP均未見明顯改變。3組左、右心房APD90值比較結(jié)果同ERP:各組組內(nèi)比較:A組APD90在各時間段隨著時間的延長顯著縮短，與基礎(chǔ)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。B組和C組在起搏1小時，3小時，6小時和基線水平APD90比較未見明顯改變;三組心房肌行免疫組化半定量檢測發(fā)現(xiàn)TH、CHAT的表達(dá)以A組為多。
　　

13、結(jié)論:
　　1）成功構(gòu)建Gαi2ctp重組腺病毒表達(dá)載體。最佳轉(zhuǎn)染時間為7天，在犬心肌組織中表達(dá)強(qiáng)陽性;
　　2）成功建立犬RAP+VNS模型，此模型能模擬迷走介導(dǎo)型房顫發(fā)生早期的電生理改變，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。模型與臨床房顫相似，具有電生理和自主神經(jīng)功能兩方面的異常;
　　3）重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Gαi2ctp使其在心肌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，致Gαi2ctp蛋白上調(diào)，進(jìn)而改變心肌電生理特性，引起心房ERP和FAPD延長，逆轉(zhuǎn)電重構(gòu)