構建和比較不同方法介導Gαi2C-terminal peptide轉染乳鼠心肌細胞去迷走神經治療心房顫動的研究.pdf

1、目的:構建攜帶Gαi2ctp的相關質粒和病毒，通過比較電穿孔法、腺病毒轉染法和9型腺相關病毒轉染法轉染Giα2ctp基因至乳鼠心肌細胞，比較不同方法的轉染效率、心肌毒性以及對膽堿類藥物迷走效應的拮抗作用，探尋Gαi2ctp基因功能表達的最適轉導途徑。
　　方法:構建重組質粒pDC316-Gαi2ctp-mCMV-EGFP、重組腺病毒rAd-Gαi2ctp-mCMV-EGFP和重組9型腺相關病毒rAVV9-Gαi2ctp-IRES-

2、EGFP以及相對應未攜帶Gαi2ctp的對照組。三種方法轉染攜帶免疫熒光蛋白(EGFP)的Gi2ctp目的基因至乳鼠心肌細胞，分別找尋最佳電轉參數和病毒最佳感染復數(MOI);比較最佳參數下不同方法轉染情況和最大效率;AlamarBlue法測各時間點還原比率評估心肌毒性，western-blot法檢測Gαi2ctp蛋白表達情況。最后分別將Gαi2ctp基因組、無基因組和空白對照組，以最適濃度的卡巴膽堿干預各組細胞，通過計數細胞整體搏動頻

3、率比較三種方法下Gαi2ctp基因的抗迷走效應差異。
　　結果:成功構建攜帶Gαi2ctp的真核轉染質粒、rAd和rAVV9。電穿孔最佳設置為:電壓:200V，脈沖時程:2ms，脈沖次數:4次/分，脈沖間隔:60s，細胞濃度:1×106/ml，質粒濃度:5ug/ml，電穿孔12h后細胞平均存活率為57.3％;rAd和rAVV9最佳MOI分別為250pfu/cell和1×107vg/cell。三種方法最佳參數下轉染效率分別為:質粒組

4、:(54.2±4.8)％于2d、rAd組:100％于1.5d和rAVV9組（59.2±4.4）％于4d;第11d轉染效率分別為（30.1±6.6）％（12±3.4）％和（36±6.1）％;Western-blot法驗證三組Gαi2ctp-EGFP蛋白成功表達;rAVV9組在全觀察期11d內細胞活性接近空白對照組(P＞0.05)，3d后電穿孔組和rAd組細胞活性開始明顯下降且后者較顯著（P＜0.05）?？ò湍憠A以最佳起效濃度1μmol·L

5、-1干預培養(yǎng)3d的各組細胞，發(fā)現(xiàn)Gαi2ctp基因組較無基因組具有明顯的抗卡巴膽堿迷走效應(P＜0.05)，但Gαi2ctp基因組間比較未見明顯差異（P＞0.05）。
　　結論:三種轉染方法皆可有效轉染乳鼠心肌細胞，但各自具有不同特點:電穿孔法轉染迅速、轉染效率尚可，但對細胞具有較大的破壞力;rAd法轉染效率最高可達100％、但表達時間較短、心肌毒性較大;AVV9法轉染起效較慢但能夠穩(wěn)定長時間表達且生物安全性最好。三種方法皆可有效