東鄉(xiāng)野生稻SRFP1基因鑒定與分析.pdf

1、東鄉(xiāng)野生稻擁有耐旱、耐冷和抗蟲病等多種優(yōu)良性狀，含有豐富的種質(zhì)基因資源，素有“植物大熊貓”之稱，在水稻種質(zhì)改良中具有重要的利用價(jià)值。植物蛋白質(zhì)泛素化降解途徑與植物調(diào)節(jié)脅迫反應(yīng)緊密相關(guān)，E3泛素連接酶是蛋白質(zhì)泛素化降解途徑的關(guān)鍵酶之一，能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)植物的非生物脅迫反應(yīng)。挖掘和開發(fā)東鄉(xiāng)野生稻的蛋白質(zhì)泛素化降解途徑關(guān)鍵基因，對(duì)于東鄉(xiāng)野生稻優(yōu)良性狀機(jī)理的研究和有利基因的開發(fā)利用具有重要意義。
　　本研究以東鄉(xiāng)野生稻為研究材料，從

2、其冬季根cDNA文庫(kù)中篩選出一個(gè)具有完整ORF閱讀框的基因SRFP1，783bp，編碼一個(gè)260個(gè)氨基酸的環(huán)指E3型蛋白。
　　通過生物信息學(xué)分析表明，東鄉(xiāng)野生稻蛋白SRFP1和擬南芥的蛋白MIEL1親緣關(guān)系比較近，它們之間蛋白氨基酸序列具有63％的相似性。該基因的啟動(dòng)子順式元件分析顯示，該基因具有ACE（光響應(yīng)元件），HSE（熱應(yīng)激響應(yīng)與元件），MSA-like（控制細(xì)胞周期的響應(yīng)元件）以及ABRE(ABA應(yīng)答元件)等響應(yīng)元件，

3、很可能接受光的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)、參與植物蛋白代謝、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及防御和脅迫應(yīng)激反應(yīng)過程。
　　為深入研究SRFP1蛋白，構(gòu)建了pET-28a(+)-SRFP1重組載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，得到相對(duì)分子量約為29.8 kD的SRFP1融合蛋白。經(jīng)過進(jìn)一步的純化分離，獲得高質(zhì)量活性融合蛋白。蛋白的熱穩(wěn)定研究分析表明該蛋白是熱不穩(wěn)定蛋白。
　　采用RT-PCR技術(shù)分析了東鄉(xiāng)野生稻SRFP1基因m

4、RNA在不同生長(zhǎng)期的根與葉的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在開花期的表達(dá)量最多。進(jìn)一步分析不同脅迫處理下東鄉(xiāng)野生稻三葉期幼苗中該基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)SRFP1基因受冷脅迫、ABA、H2O2、NaCl、PEG6000等的誘導(dǎo)表達(dá)，在ABA誘導(dǎo)下SRFP1基因明顯增加，是對(duì)照的11倍，說明SRFP1蛋白是東鄉(xiāng)野生稻ABA依賴的信號(hào)通路的效應(yīng)蛋白。
　　本研究克隆了東鄉(xiāng)野生稻SRFP1基因，通過生物信息學(xué)分析該基因和蛋白基本特性;原核克隆表達(dá)了該