普通野生稻miRNA的鑒定與分析.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)中起重要作用的非編碼RNA。普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)是栽培稻的近緣祖先,是改良栽培稻的重要種質(zhì)資源。為了揭示普通野生稻向栽培稻馴化過程中miRNA的變化,并克隆普通野生稻中的miRNA,本研究利用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)海南萬寧普通野生稻小RNA文庫(kù)進(jìn)行了分離、鑒定及表達(dá)分析,對(duì)本項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)的只在普通野生稻中出現(xiàn)的miRNA構(gòu)建植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化

2、水稻品種日本晴,為普通野生稻中miRNA的功能分析奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.小 RNA文庫(kù)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析
　　 利用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái),分析了普通野生稻小RNA文庫(kù),共得到高質(zhì)量序列8558370個(gè),共2307484種；通過對(duì)所有的sKNA序列Blastn比對(duì)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(miRBase15.0)中已知的miRNA,在普通野生稻中發(fā)現(xiàn)了屬于25個(gè)家族的104種保守的miRNAs,對(duì)比了它

3、們?cè)谠耘嗟局斜磉_(dá)情況的異同；對(duì)普通野生稻測(cè)到次數(shù)最多的前四位:miR156,miR168,miR528,miR166,不同于水稻高通量測(cè)序的保守miRNA家族的前四位:miR169,miR156,miR168,miR172;發(fā)現(xiàn)215個(gè)水稻中特異的miRNA,屬于78個(gè)家族；經(jīng)UNAFOLD分析預(yù)測(cè),353個(gè)小RNA對(duì)應(yīng)的水稻基因組序列能形成發(fā)卡環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)一步通過是否有互補(bǔ)鏈miRNA*存在及二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能分析,得到了23個(gè)新的mi

4、RNA；對(duì)23個(gè)新的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),共發(fā)現(xiàn)11個(gè)新的miRNA有17個(gè)靶基因。
　　 2.候選新miRNA的實(shí)驗(yàn)鑒定
　　 提取普通野生稻小分子量RNA,利用改進(jìn)的莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)一步對(duì)能形成發(fā)卡環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)的353個(gè)預(yù)測(cè)的小RNA序列進(jìn)行了表達(dá)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了確定的有互補(bǔ)鏈miRNA*存在23個(gè)新的miRNA,還有32個(gè)序列通過莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄之后PCR擴(kuò)增,連接到克隆載體,測(cè)序得到了目的序列片段,說明這

5、32個(gè)序列在普通野生稻中有表達(dá),可能也是新的miRNA。對(duì)這32個(gè)可能的新miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),23個(gè)預(yù)測(cè)到了靶基因序列。
　　 3.新miRNA的表達(dá)分析及轉(zhuǎn)化栽培稻日本晴
　　 利用RT-PCR檢測(cè)了CWR-miR28,CWR-miR61,CWR-miR64,CWR-miR68,CWR-miR153,CWR-miR200,CWR-miR264,CWR-miR308在普通野生稻中的表達(dá)情況。所有的檢測(cè)對(duì)象在所有部位