藤縣藥用野生稻內(nèi)生固氮菌分離與鑒定.pdf

1、固氮菌資源的收集挖掘可以幫助微生物肥料的研究與開發(fā)，微生物肥料與化肥合理搭配還能提高化肥利用率，在保證作物產(chǎn)量的同時(shí)減少成本和污染。本研究以廣西自治區(qū)梧州市藤縣蒙江鎮(zhèn)那塘村一處山洼的藥用野生稻為研究材料，采用三種無氮培養(yǎng)基經(jīng)平板劃線分離法篩選內(nèi)生固氮菌，通過乙炔還原法測(cè)定其固氮酶活性和同位素豐度法驗(yàn)證固氮能力；利用IS-PCR(Insertion sequence-based PCR)指紋圖譜和SDS-PAGE全細(xì)胞蛋白電泳指紋圖譜對(duì)獲

2、得的內(nèi)生固氮菌進(jìn)行聚類分析；對(duì)于各個(gè)類群的代表菌株，根據(jù)16S rRNA基因序列分析確定其分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；使用溶解透明圈法定性檢測(cè)溶磷解硅能力；Salkowski比色法定量測(cè)其產(chǎn)生長(zhǎng)素能力；鉬銻抗比色法定量測(cè)其溶磷能力；2,4-二硝基苯肼比色法定量測(cè)其 ACC脫氨酶活性；絡(luò)天氰（CAS）法檢測(cè)產(chǎn)鐵載體。主要得出以下研究結(jié)果：
　?。?）從供試材料中分離純化獲得34株內(nèi)生固氮菌，其固氮酶活性介于5.0到1036.7 nmol/mL

3、?h之間。分離獲得的菌株用IS-PCR指紋圖譜和SDS-PAGE全細(xì)胞蛋白電泳指紋圖譜可聚為5個(gè)類群，類群I和II各有8株，類群III、IV、V分別有2株、5株和11株。固氮酶活性最高的菌株HU31，同位素豐度法檢測(cè)15N同位素豐度達(dá)到25.15％，超過自然豐度0.36%。
　?。?）各個(gè)類群代表菌株16S rRNA基因序列分析表明：類群I代表菌株HU33與無乳固氮螺菌（Azospirillum amazonenseATCC351

4、19T）相似性為97.13%；類群II代表菌株HU31與變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicolaDSM15968T）相似性為99.71%；類群III代表菌株HU17與蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteiliiATCC700476T）相似性為99.86%；類群IV代表菌株HU13與黃黃色桿菌（Xanthobacter flavusATCC35867T）相似性為100%；類群 V代表菌株 CM05與越南伯克霍爾

5、德菌（Burkholderia vietnamiensisLMG10929T）相似性為99.86%。
　?。?）代表菌株HU31和CM05都可以溶磷脫硅；比色法定量測(cè)出菌株HU31和CM05的解磷能力分別為105.4±6.9μg/mL和71.8±9.0μg/mL。代表菌株HU31、HU17和CM05有產(chǎn)鐵載體能力。5個(gè)類群的代表菌株都具有產(chǎn)生長(zhǎng)素能力，在有色氨酸存在的情況下，菌株HU13、HU17和HU31的產(chǎn)生長(zhǎng)素能力顯著高于沒

6、有色氨酸存在的時(shí)候，說明這三株內(nèi)生菌生長(zhǎng)素合成途徑依賴色氨酸。5個(gè)類群代表菌株都具有ACC脫氨酶活性。
　　（4）代表菌株HU31在低氮液體培養(yǎng)情況下，使充滿N2的密封塑料瓶凹陷。
　　本研究分離篩選的野生稻內(nèi)生固氮菌具有生物多樣性，并且具有一定的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用潛力，為微生物肥料生產(chǎn)收集了菌種資源；類群I代表菌株HU33可能是一個(gè)新類群，有待于DNA雜交和電子顯微鏡觀察進(jìn)一步驗(yàn)證；類群II代表菌株HU31在低氮液體培養(yǎng)情況下也