29015.甘蔗內(nèi)生固氮菌的分離鑒定及16srrna基因克隆和序列分析

1、福建師范大學(xué)碩士學(xué)位論文甘蔗內(nèi)生固氮菌的分離鑒定及16SrRNA基因克隆和序列分析姓名：周發(fā)俊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：王逸群20090601中文文摘中文文摘甘蔗是熱帶、亞熱帶禾本科C4植物，是主要的制糖原料，也可以用它生產(chǎn)工業(yè)酒精。世界上甘蔗種植面積最大的國(guó)家是巴西，其次是印度，中國(guó)位居第三，在中國(guó)主要分布在廣西、廣東、福建、臺(tái)灣、四川、云南、江西、貴州、浙江、湖南、湖北等省份。氮元素是空氣中的主要成分之一，游離型的

2、氮?dú)獠荒鼙淮蠖鄶?shù)生物直接利用，必須還原成氨類化合物才能被生物所利用，在這個(gè)生化反應(yīng)過(guò)程中生物固氮發(fā)揮了重要作用。生物固氮占地球上固氮總量的90％，對(duì)維持地球生態(tài)平衡有著重要意義。除了豆科植物，目前在甘蔗、玉米等作物上也發(fā)現(xiàn)了有固氮微生物存在。利用固氮生物的白生固氮能力進(jìn)行固氮，不僅提高固氮效率，而且可以節(jié)省大量能源。甘蔗是南方地區(qū)的經(jīng)濟(jì)作物，種植面積非常大。對(duì)生物固氮進(jìn)行研究，對(duì)于緩解能源短缺和解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中造成的環(huán)境污染等問(wèn)題，具有重

3、要意義。如果能在甘蔗體內(nèi)分離出固氮能力強(qiáng)的固氮菌，并對(duì)其進(jìn)行研究，構(gòu)建出工程菌株，對(duì)于解決當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際問(wèn)題開辟了一個(gè)新的途徑。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在內(nèi)生固氮菌的研究中，已經(jīng)取得了很多有意義的進(jìn)展。1986年Barbara從卡拉草內(nèi)分離到了固氮弧菌(Azoarcussp)，可用于牧草生產(chǎn)中；1987年巴西Dobereiner實(shí)驗(yàn)室從甘蔗體內(nèi)分離到醋酸固氮菌(Acetobacteriazotrophicus)，該菌株具有非常高的固氮能力，可以提

4、供甘蔗生產(chǎn)中五分之三的氮元素；我國(guó)學(xué)者在水稻和玉米內(nèi)生固氮菌的研究中，做了大量工作，1981年丘元盛等從廣東水稻根中分離出糞產(chǎn)堿菌和陰溝桿菌，尤崇杓對(duì)它們的生理特性及其與水稻的相互作用開展了深入研究，采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建了水稻固氮工程菌株。前人的研究工作給我們很多重要啟示，我們從福州本地現(xiàn)有主要甘蔗栽培品種的根部進(jìn)行固氮菌的分離，純化得至IJl2株形態(tài)大小質(zhì)地各異的菌種，用乙炔還原法測(cè)定菌種固氮酶活性，獲得6株酶活較高的菌株。對(duì)分離出

5、的菌株進(jìn)行生理生化指標(biāo)初步鑒定；用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)這些細(xì)菌的16SrRNA基因進(jìn)行克隆，并對(duì)基因序列進(jìn)行了分析，建立了系統(tǒng)發(fā)育樹，在進(jìn)化上確立了菌株間的親緣關(guān)系。16SrRNA基因序列分析結(jié)果與生物梅里埃公司W(wǎng)IPEK32鑒定儀生理生化測(cè)定結(jié)果以及形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果一致，且經(jīng)判定這些菌株均是屬于固氮菌屬。將12株菌的16SrRNA基因序列提交至lJGenbank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了序列號(hào)：EU931548、EU931549、EU931551、V