香根草內(nèi)生固氮菌的分離、鑒定及其生長(zhǎng)特性和回接效應(yīng)的研究.pdf

1、固氮微生物具有將氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨的能力，稱為生物固氮?？諝庵屑s80％的氮?dú)獠荒鼙恢参镏苯永茫梢酝ㄟ^生物固氮作用間接被植物吸收。據(jù)統(tǒng)計(jì)，生物固氮量約占全球植物需氮量的3/4。豆科植物與根瘤菌的共生固氮體系是自然界效率較高的固氮體系之一，國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行了相關(guān)方面的大量研究。但是大部分糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物是非豆科植物，關(guān)于非豆科植物的生物固氮近年來成為生物固氮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。1975年，DObereiner發(fā)現(xiàn)了與禾本科植物聯(lián)合共生固氮的細(xì)菌：固

2、氮螺菌(Azos-pirillum)，并提出根際聯(lián)合共生固氮的概念。但是由于聯(lián)合固氮菌與宿主根系之間只是一種“松散”的聯(lián)合關(guān)系，沒有分化出特異結(jié)構(gòu)。受多種環(huán)境因素的影響，聯(lián)合固氮效率不及共生固氮高，限制了聯(lián)合固氮菌在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。 內(nèi)生固氮為生物固氮領(lǐng)域開辟了一個(gè)新的方向。內(nèi)生固氮菌在植物體內(nèi)的定殖環(huán)境適于固氮作用，已有報(bào)道表明其固氮酶結(jié)構(gòu)基因在植物細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞間隙和木質(zhì)部導(dǎo)管可以表達(dá)。由于內(nèi)生固氮菌占據(jù)著有利的生態(tài)位，不僅避免

3、了化合態(tài)氮的抑制和土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)，而且可以以不同的方式使植物受益，如直接給宿主提供氮營(yíng)養(yǎng)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。因此，深入研究?jī)?nèi)生固氮菌的生理生化特性，生長(zhǎng)特性以及其與植物宿主之間的相互作用，對(duì)于提高非豆科植物生物固氮的效率和發(fā)展可持續(xù)生態(tài)農(nóng)業(yè)具有重要的意義。 本實(shí)驗(yàn)利用Ashby無氮培養(yǎng)基從香根草體內(nèi)分離得到10株細(xì)菌，經(jīng)美國(guó)BD phoe-nixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和美國(guó)BBL Crystal微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，可知

4、菌株MJ-1、MJ-2和MJ-5為陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)；MJ-3為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；MJ-4為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；MJ-6、MJ-7和MJ-9為洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)；MJ-8為肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種(Klebsiella pneumoniae subsp.)；MJ-10為短小芽孢桿菌(B

5、acillus pumilus)。進(jìn)一步鑒定了上述各菌株其他方面生理生化特性。采用國(guó)際上通用的乙炔還原法檢測(cè)細(xì)菌的固氮酶活性，發(fā)現(xiàn)菌株MJ-2和MJ-4固氮酶活性較高。將這兩株菌作為目標(biāo)菌株，以16s rDNA分子作為指標(biāo)鑒定細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位，結(jié)果表明MJ-2為腸桿菌屬陰溝腸桿菌菌種，MJ-4為克雷白氏桿菌屬肺炎克氏桿菌菌種。 以MJ-2和MJ-4為待測(cè)菌株，探討氧氣，紫外線，以及不同滲透壓、氮源、碳源、酸堿度和溫度等環(huán)境因子

6、對(duì)它們生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，這兩株菌都是兼性厭氧細(xì)菌，對(duì)紫外線有較強(qiáng)的抵抗力，并且對(duì)環(huán)境因子的適應(yīng)范圍較廣。鑒于香根草對(duì)土壤有極強(qiáng)的適應(yīng)性，能在貧瘠，板結(jié)的土壤上照樣生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了菌株的溶磷性，以便探究香根草對(duì)土壤的適應(yīng)性是否與內(nèi)生固氮細(xì)菌的溶磷性有關(guān)。結(jié)果表面MJ-2和MJ-4均能在PKO培養(yǎng)基上形成明顯的透明圈，具有溶磷性。但是否與香根草對(duì)土壤的適應(yīng)性有關(guān)，還需做進(jìn)一步研究。 取本實(shí)驗(yàn)室保存的含pMGFP2.1表達(dá)載

7、體的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)。此表達(dá)載體含有肺炎克氏桿菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter) Trevisan)M5a1的固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifH的啟動(dòng)子和其起始密碼子以及發(fā)射熒光強(qiáng)度比野生型GFP強(qiáng)100倍的三位點(diǎn)突變GFP(S65A，V68L，S72A)片段。而且pMGFP2.1上還插入卡那霉素(Kan)抗性基因，有助于保持轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性。利用三親交配法將pMGFP2.1導(dǎo)入MJ-4，使用含Kan的Ashby無氮

8、培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。熒光顯微鏡下，用藍(lán)光激發(fā)，轉(zhuǎn)化子MJ-4發(fā)出微弱的綠色熒光。限菌培養(yǎng)條件下，用轉(zhuǎn)化子MJ-4接種香根草無菌苗，培養(yǎng)2周后，取接菌的無菌苗的根，未接菌的根作為對(duì)照，做徒手切片。激光共聚焦掃描電子顯微鏡拍照證實(shí)細(xì)菌在香根草根組織中存在，而對(duì)照沒有，并且接菌后植物的鮮重和株高增加量相比對(duì)照均有顯著提高，說明MJ-4對(duì)植物的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。用Ashby無氮培養(yǎng)基從上述回接MJ-4的香根草根內(nèi)分離固氮細(xì)菌，并擴(kuò)增該菌株16