東鄉(xiāng)野生稻基因組雙元細(xì)菌人工染色體（BIBAC2）文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、BIBAC載體設(shè)計(jì)的具有許多優(yōu)于YAC和PAC的方面。它不會(huì)出現(xiàn)重組交換而導(dǎo)致的基因嵌合現(xiàn)象，可以在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中進(jìn)行穿梭；在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下能直接將外源基因整合到植物基因組中，一旦獲得目標(biāo)陽(yáng)性克隆后，不需要進(jìn)行亞克隆就可以直接轉(zhuǎn)化植物，進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)；驗(yàn)證功能后含有目的基因的克隆，即使基因結(jié)構(gòu)未知，也可直接進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因育種工作，加速分子育種的研究進(jìn)程。 東鄉(xiāng)野生稻(2n=24)是世界緯度最北(位于東經(jīng)116°36′，北緯2

2、8°14′)的普通野生稻，它在-12.8～0℃低溫條件下仍能安全越冬，具宿根(多年生)，再生力和繁殖(無(wú)性)力強(qiáng)，耐旱、耐貧瘠及多種抗逆性等各種有利性狀及含胞質(zhì)不育基因、廣親和基因、恢復(fù)基因、抗病蟲基因等多種有利基因。 本研究在參考了前人BIBAC、TAC和BAC文庫(kù)構(gòu)建方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)改進(jìn)建立了～套可轉(zhuǎn)化大片段文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)體系。包括載體的制備、高分子量DNA的提取、酶切條件的確定、片段大小的選擇、目的大片段的回收、連接及轉(zhuǎn)化

3、體系，最終獲得了所需大小的插入片段，重組率高的BIBAC文庫(kù)構(gòu)建體系。 利用所建立的BIBAC文庫(kù)構(gòu)建體系，以BIBAC2為載體，構(gòu)建了東鄉(xiāng)野生稻BIBAC2文庫(kù)，選擇野生稻幼嫩葉片，提取高分子量DNA，選擇合適的酶量，選取50-100kb左右范圍的片段。到目前為止共獲得了14592個(gè)重組克隆，通過(guò)隨機(jī)挑取26個(gè)克隆采用堿裂解法提取質(zhì)粒，瓊脂糖脈沖電泳結(jié)果表明空載率為7.8％，克隆重組率為92.2％平均插入片段為65kb，覆蓋東