Pima90-53細(xì)菌人工染色體（BAC）文庫構(gòu)建及抗黃萎病相關(guān)基因篩選.pdf

1、棉花是當(dāng)今人類栽培的主要作物之一和天然纖維的首要來源。目前，四倍體的陸地棉(GossypiumhirsutumL.)和海島棉(GossypiumbarbadenseL.)是世界各國的主要栽培種，它們分別占世界棉花總產(chǎn)量的90﹪和8﹪。海島棉纖維細(xì)長(zhǎng)、強(qiáng)力高、抗病性較強(qiáng)，是品質(zhì)最優(yōu)的栽培種。因此構(gòu)建海島棉品種的BAC文庫，利用國內(nèi)外已有分子標(biāo)記探針釣取和分析含有重要性狀的BAC克隆，是發(fā)掘分子標(biāo)記、克隆纖維發(fā)育相關(guān)基因和抗病基因、深入開展

2、棉花功能和比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。對(duì)于顯著提高我國棉花遺傳育種研究水平具有重要意義和應(yīng)用前景。 本研究以優(yōu)質(zhì)抗病海島棉品種Pima90-53為材料，在本課題組BAC文庫構(gòu)建方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了一些改進(jìn)，補(bǔ)充構(gòu)建了該品種的BAC文庫，獲得了77,568個(gè)克隆，使得該文庫的克隆總數(shù)達(dá)到167,424個(gè)。 隨機(jī)挑取224個(gè)克隆進(jìn)行插入片段大小檢測(cè)，其平均片段大小介于50kb～260kb之間，平均插入片段為130kb，94

3、﹪的插入片段在100kb以上，空載率小于4﹪；該基因組文庫中葉綠體基因的污染率低于0.2﹪；該文庫覆蓋海島棉基因組的7.2倍；Southern雜交結(jié)果表明所構(gòu)建的Pima90-53BAC文庫具有較高的忠實(shí)度；隨機(jī)挑取7個(gè)克隆進(jìn)行繼代培養(yǎng)100代，提取質(zhì)粒酶切檢測(cè)表明不存在片段丟失現(xiàn)象，表明該文庫的克隆在大腸桿菌中能夠穩(wěn)定保存；用單拷貝的分子標(biāo)記Fb38和多拷貝的分子標(biāo)記MYB作為探針對(duì)該文庫進(jìn)行了部分篩選，分別得到2個(gè)和40個(gè)陽性克隆。

4、這些結(jié)果表明該文庫具有較高的質(zhì)量，為開展棉花重要性狀基因的圖位克隆、棉花物理作圖、基因組測(cè)序和SSR引物開發(fā)等應(yīng)用提供了重要基因組資源。 以黃萎病菌誘導(dǎo)下差異表達(dá)的棉花抗病相關(guān)基因片段PR8為探針，利用雜交方法，對(duì)所構(gòu)建的優(yōu)質(zhì)、抗病海島棉品種Pima90-53BAC文庫進(jìn)行了篩選。從30,336個(gè)BAC克隆中篩選到含有PR8基因片段的4個(gè)陽性克隆，分別為127K13、128D14、169J3和178C5。用Sau3AⅠ對(duì)其中的1

5、69J3克隆進(jìn)行酶切，回收2kb～4kb的DNA片段并連接到載體pUC118BamHⅠ-BAP上，構(gòu)建了含有該基因片段的亞克隆文庫，該文庫共含有4,224個(gè)克隆，平均插入片段為2kb。通過對(duì)亞克隆的測(cè)序分析初步得到了一條與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因片段，該片段長(zhǎng)2.3kb，含有五個(gè)開放閱讀框。通過比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該基因片段與水、冷害、莖點(diǎn)霉屬脅迫下表達(dá)的基因有較高的同源性，該片段可能在棉花抗病反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)中起作用。該基因片段的獲得為得到抗黃萎病相