東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系表觀(guān)遺傳變化研究.pdf

1、漸滲雜交是利用野生有利基因，創(chuàng)造種間變異，選育新品種的一個(gè)重要途徑。然而外源DNA漸滲過(guò)程中能夠引起廣泛的遺傳和表觀(guān)遺傳變異，這很大程度上阻礙了野生有利基因在實(shí)際育種中的充分利用。此外，諸如逆轉(zhuǎn)座子和甲基化這類(lèi)表觀(guān)遺傳變異將對(duì)生物體基因組結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生重大影響，進(jìn)而導(dǎo)致植物表型發(fā)生明顯改變。本研究利用東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系IL5335和IL5243(IL5335的自交后代仍具有分離性狀)為試材，對(duì)其Tyl-copia類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)

2、及表達(dá)活性進(jìn)行分析，并利用MSAP和SSAP的方法研究其DNA甲基化以及逆轉(zhuǎn)座子多樣性變化。旨在探明高世代耐冷漸滲系表型不穩(wěn)定與其表觀(guān)遺傳變異之間的關(guān)系，為有效的利用外源優(yōu)異基因進(jìn)行作物改良提供參考。主要結(jié)果如下：
　　 ⑴東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系中逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列克隆與表達(dá)分析。以東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系IL5335、IL5243及其雙親為試材，克隆得到75條存在高度異質(zhì)性的Tyl-copia類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，進(jìn)一步分析這些

3、逆轉(zhuǎn)錄酶序列可分為7個(gè)家族;家族6和7含有65條逆轉(zhuǎn)錄酶序列，序列間的相似性為44.9％-99.3％;家族1-5中僅含10條逆轉(zhuǎn)錄酶序列，其中8條來(lái)源于耐冷漸滲系，2條來(lái)自于東鄉(xiāng)野生稻，其與親本序列間相似性范圍為29.2％-52.8％，分析發(fā)現(xiàn)這些序列曾發(fā)生缺失或插入突變。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，IL5335和IL5243中houba、osr15以及osr17逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)量均遠(yuǎn)高于受體親本中的表達(dá)量（表達(dá)量增加1.50-5.0

4、7倍），表明漸滲雜交誘發(fā)改變了IL5335和IL5243中逆轉(zhuǎn)錄酶序列的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)活性。
　　 ⑵東鄉(xiāng)野生稻耐冷漸滲系DNA甲基化變化研究。利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)的方法，對(duì)親本以及耐冷漸滲系IL5335和IL5243進(jìn)行了全基因組胞嘧啶DNA甲基化水平和甲基化模式變化分析。結(jié)果表明，親本XB和DWR甲基化變化（全甲基化和半甲基化）水平分別為15.84％和11.79％。與親本相比，耐冷漸滲系IL5335和IL524

5、3發(fā)生了不同程度的胞嘧啶DNA甲基化水平(分別為14.14％和15.90％)的改變。甲基化模式變化分析發(fā)現(xiàn)，耐冷漸滲系后代中大部分繼承了親本的DNA甲基化模式，僅32個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了去甲基化模式變化以及59個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了過(guò)甲基化模式變化。克隆測(cè)序得到的17條存在甲基化模式變化的序列，這些序列與GenBank中編碼蛋白序列、反轉(zhuǎn)座子序列以及已知功能基因序列具有很高的相似性。并且實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)在耐冷漸滲系IL5335和IL5243中，

6、發(fā)生了去甲基化的耐冷相關(guān)基因CHY1和MAPK的表達(dá)量均高于親本，表明東鄉(xiāng)野生稻漸滲誘發(fā)改變了IL5335和IL5243 DNA甲基化水平和模式，進(jìn)而引起基因表達(dá)量的改變。這些研究結(jié)果為有效地挖掘與利用外源優(yōu)異基因進(jìn)行作物改良奠定基礎(chǔ)。
　　 ⑶利用SSAP對(duì)東鄉(xiāng)野生稻漸滲系遺傳多樣性分析。利用序列擴(kuò)增多態(tài)性(SSAP)對(duì)46個(gè)材料包括東鄉(xiāng)野生稻漸滲系、中國(guó)栽培稻以及國(guó)外栽培稻進(jìn)行遺傳多樣性分析。SSAP序列特異性引物根據(jù)Tyl