視網(wǎng)膜Sonic hedgehog信號介導(dǎo)PI3K-AKT通路在豚鼠形覺剝奪性近視模型中的作用及機制研究.pdf

1、本課題中采用豚鼠的形覺剝奪性近視(form-deprivationmyopia, FDM)模型，通過玻璃腔內(nèi)注射PI3K/AKT通路特異性抑制劑LY294002阻斷該通路以及玻璃腔內(nèi)注射外源性Shh-N和特異性抑制劑cyclopamine以激活和抑制Shh的表達，觀察實驗動物眼軸、屈光度以及Shh、PI3K/AKT通路信號因子的變化情況，同時檢測鞏膜組織堿性成纖維細胞生長因子(basic FibroblastGrowth Factor，

2、bFGF)、MMP-2等的改變，探索Shh信號因子對近視調(diào)控作用的中間通路和具體調(diào)控途徑，建立完整的信號通路，為近視眼防治提供依據(jù)。
　　第一部分:豚鼠形覺剝奪性近視眼視網(wǎng)膜PI3K/AKT通路信號因子及鞏膜
　　MMP-2等下游因子的表達變化
　　目的:在豚鼠形覺剝奪性近視模型(FDM)中檢測視網(wǎng)膜PI3K/AKT通路信號因子的表達變化，觀察鞏膜中MMP-2和bFGF含量的改變。
　　方法:72只2-3周齡三色

3、健康豚鼠隨機分為FDM組(n=48)和空白對照組(control組)(n=24)。FDM組右眼眼周黏貼半透明薄膜，左眼及對照組不作任何處理。FDM組和對照組分別于形覺剝奪0周、1周、2周及4周各取6只豚鼠進行檢影驗光及眼軸長度等生物學(xué)測量后，處死取眼球行免疫熒光染色檢測視網(wǎng)膜PI3K、AKT的表達水平，實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescentquantitative reverse transcript

4、ion polymerase chain reaction, real-time PCR)檢測視網(wǎng)膜PI3K、AKT的mRNA水平變化，Western-blot檢測視網(wǎng)膜PI3K、AKT蛋白表達水平及鞏膜組織中bFGF、MMP-2的表達變化。
　　結(jié)果:三組豚鼠的前房深度、晶狀體厚度比較差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。免疫熒光染色顯示，PI3K、AKT彌漫表達于豚鼠視網(wǎng)膜各層。FDM組中遮蓋眼PI3K、AKT的mRNA表達水平在第1周開始較

5、對側(cè)眼明顯升高，在形覺剝奪4周時最為顯著（P值分別為0.0052和＜0.001）。Western blot結(jié)果顯示，形覺剝奪第2周開始，遮蓋眼的PI3K、AKT蛋白表達水平開始較左眼顯著升高，并持續(xù)至第4周;遮蓋眼鞏膜MMP-2在剝奪第2周后開始顯著升高，而bFGF表達水平亦在形覺剝奪第2周顯著上升，并持續(xù)至第4周。
　　結(jié)論:在半透明薄膜法誘導(dǎo)的豚鼠FDM中，視網(wǎng)膜組織PI3K、AKT表達水平升高，同時伴隨鞏膜組織bFGF、MM

6、P-2表達的上升，提示PI3K、AKT信號通路可能參與了豚鼠FDM的調(diào)控過程。
　　第二部分:玻璃體腔內(nèi)注射PI3K/AKT通路特異性抑制劑阻斷PI3K/AKT通路對豚鼠近視發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)機制研究
　　目的:通過豚鼠玻璃體腔內(nèi)注射PI3K/AKT通路特異性抑制劑LY294002來觀察阻斷該通路后對豚鼠近視發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)因子表達水平的變化。
　　方法:將出生2-3周齡三色健康豚鼠54只隨機分為3組，每組18只

7、。每組的右眼進行眼周黏貼半透明薄膜建立FDM模型，左眼作為自身對照（不予任何處理）。雙眼同時進行LY294002玻璃體腔注射，每次在固定時間進行注射，隔1天注射一次，共注射3次，三組注藥濃度分別為10M/L、20uM/L、40uM/L。分別在建模的第0、1、2、4周進行驗光和眼軸等生物學(xué)測量后，處死取眼球視網(wǎng)膜組織行RT-PCR檢測Shh通路信號因子的表達變化，取鞏膜組織進行Western-Blot檢測Shh、MMP-2和bFGF蛋白表

8、達水平。
　　結(jié)果:在遮蓋的第1，2，4周，3組玻璃體腔注藥豚鼠中，三組間比較及與第一部分結(jié)果比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。3組豚鼠右眼較對側(cè)眼眼軸長度和玻璃體腔長度的延長比較以及和第一部分結(jié)果比較，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。三組豚鼠Shh的mRNA表達水平比較以及和第一部分單純FDM引起的Shh的mRNA表達水平比較，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western-Blot結(jié)果顯示，在FDM2

9、周，三組間Shh蛋白的表達隨注藥濃度逐漸減少，且均少于第一部分的FDM2周水平;鞏膜組織MMP-2蛋白的變化和Shh蛋白相同，但bFGF蛋白表達變化不顯著。
　　結(jié)論:阻斷PI3K/AKT信號通路后，豚鼠形覺剝奪所產(chǎn)生的近視有所抑制，表明PI3K/AKT信號通路可能是實驗動物形覺剝奪性近視發(fā)生、發(fā)展的中間通路;PI3K/AKT信號通路抑制后，Shh信號因子mRNA表達的上調(diào)較單純FDM引起的mRNA表達上調(diào)出現(xiàn)顯著地延緩和抑制，且

10、這種抑制作用和濃度呈正相關(guān)，表明PI3K/AKT可以反向作用于Shh信號通路，或者說Shh可以通過介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用。
　　第三部分:玻璃體腔內(nèi)注射Shh-N溶液、FDM豚鼠玻璃體腔內(nèi)注射Shh特異性抑制劑Cyclopamine對豚鼠形覺剝奪性近視發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)機制研究
　　目的:分別在豚鼠玻璃體腔內(nèi)注射Shh-N溶液激活Shh信號通路、在FDM豚鼠玻璃體腔注射Cyclopamine阻斷Shh信號通路

11、后觀察兩種干預(yù)方式對近視發(fā)生、發(fā)展的作用，同時檢測PI3K/AKT通路信號因子以及下游鞏膜中MMP-2及bFGF表達水平的變化，研究Shh通路和PI3K/AKT通路之間的交互對話，進一步探索Shh作用的中間通路和作用路徑。
　　方法:分別將出生2-3周齡三色健康豚鼠48只隨機分為2組(A)、72只分為3組(B)。三(A)的2組豚鼠分別進行右眼Shh-N溶液的玻璃體腔注射，左眼進行BSA的注射作為對照組。每次注射10μl，每次在固定

12、時間進行注射，隔2天注射一次，共注射4次。兩組的Shh-N注射濃度分別為20μg/ml和50μg/ml。在注藥前及注藥后2周進行驗光和眼軸等生物學(xué)測量，處死取眼球取視網(wǎng)膜組織行PI3K/AKT信號因子的mRNA和蛋白檢測，取鞏膜組織進行Western-Blot檢測MMP-2和bFGF蛋白表達水平。三(B)的三組豚鼠每組的右眼進行半透明薄膜遮蓋，同時雙眼進行相同濃度cyclopamine注射。雙眼依次進行玻璃體腔內(nèi)注射，隔2天注射一次，每

13、次每只眼球注射10μl，共注射4次。3組的cyclopamine注藥濃度分別為0μg/ml（溶劑，F(xiàn)DM0組）、50μg/ml（FDM50組）及200μg/ml（FDM200組）。在注藥后的第2周進行觀察檢測，檢測項目同三(A)。
　　結(jié)論:Shh信號通路激活、阻斷后，實驗動物眼屈光狀態(tài)和PI3K/AKT通路的信號因子分別發(fā)生了相應(yīng)的、且變化趨勢一致的改變，說明Shh分子可能是通過介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路作用于下游的因子，調(diào)控

14、了近視的發(fā)生和發(fā)展。
　　第四部分:玻璃體腔內(nèi)同時注射Shh-N溶液、PI3K/AKT通路特異性抑制劑LY294002對豚鼠近視發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)機制研究
　　目的:通過豚鼠玻璃體腔內(nèi)同時注射Shh-N溶液、PI3K/AKT通路特異性抑制劑LY294002來直接驗證PI3K/AKT通路是否為Shh調(diào)控近視發(fā)生發(fā)展的唯一中間路徑。
　　方法:將出生2-3周齡三色健康豚鼠48只隨機分為2組，每組24只。每組的右眼進行Sh

15、h-N溶液和LY294002玻璃體腔注射，另一眼進行Shh-N溶液和LY294002溶劑（0.1％ BSA，牛血清蛋白）注射，兩組Shh-N的注射濃度分別為25、50ug/mL，LY294002的注射濃度為40uM/L。每次在固定時間進行注射，隔1天注射一次，共注射4次.分別在注射的第14天（2周）進行驗光和眼軸等生物學(xué)測量后，處死取眼球鞏膜組織進行Western-Blot檢測MMP-2和bFGF蛋白表達水平。
　　結(jié)果:兩組豚鼠

16、注藥后左眼較右眼分別誘導(dǎo)出了-1.03±0.74D、-2.15±0.92D的近視;眼軸長度左眼較右眼延長了0.07±0.03mm、0.12±0.05mm;玻璃體腔長度延長了0.06±0.02mm、0.11±0.05mm;兩組豚鼠左眼和第三部分中單純注射Shh-N溶液相比較，差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;兩組間比較，右眼的屈光度、眼軸長度、玻璃體腔長度差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);右眼結(jié)果與第一部分空白對照組比較差異無顯著