新城疫病毒通過PKR-PERK和GADD34-PP1調(diào)控eIF2α的磷酸化和翻譯起始效率的研究.pdf

1、新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的，在家禽和野生鳥類廣泛傳播的疾病。NDV屬于副粘病毒科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），為單股負鏈、不分節(jié)段的RNA病毒。
　　真核翻譯起始因子2α（Eukaryotic Initiation Factor2α, eIF2α）Ser51位點磷酸化抑制蛋白翻譯起

2、始，是細胞應對各種應激采取的保護策略。例如，細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白積累，病毒感染，氨基酸饑餓等。宿主細胞內(nèi)有四種能引起 eIF2α磷酸化的激酶：PKR（ double-stranded RNA-dependent protein kinase）， PERK（ PKR-like ER kinase）， GCN(general control non-derepressible-2)，HRI(heme-regulated inhibito

3、r)。
　　RNA病毒感染細胞，促使干擾素分泌增加，誘導PKR上調(diào)表達。病毒增值產(chǎn)生的dsRNA激活PKR，進而磷酸化eIF2α，導致蛋白翻譯關(guān)閉。大量未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，GRP78（78 kDa glucose-regulated protein）從PERK解離，PERK發(fā)生二聚化并自我磷酸化。活化的PERK磷酸化eIF2α，導致蛋白翻譯關(guān)閉，進而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。eIF2α的磷酸化卻能促進激活轉(zhuǎn)錄因子 ATF4（activ

4、ating transcription factor4）mRNA翻譯，進而增強 GADD34(growth arrest and DNA damage-inducible protein34)表達。
　　蛋白磷酸酶1（Protein phosphatase1, PP1）是真核生物主要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，通過催化亞基 PP1c與不同調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，形成復合體，執(zhí)行多種多樣的生物學功能。其中一個重要調(diào)節(jié)亞基是GADD34，eIF2α

5、磷酸化時上調(diào)表達，幫助PP1去磷酸化eIF2α，從而恢復蛋白翻譯。
　　病毒感染通常引起細胞壓力應激，并通過磷酸化eIF2α介導感染細胞的蛋白翻譯關(guān)閉。NDV感染能引起家禽快速死亡，并能選擇性殺死人的癌細胞，其具體分子機制尚未清楚。
　　本項目著重于研究 NDV調(diào)控主細胞蛋白翻譯系統(tǒng)的分子機制。嘌呤霉素標記實驗表明，在 NDV感染前期（0-12小時），人子宮頸癌細胞（HeLa）和雞成纖維細胞（DF-1）蛋白翻譯維持在活躍狀態(tài)

6、，而在感染后期（12-24小時）蛋白翻譯效率逐漸降低。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，eIF2αSer51位點的磷酸化抑制了蛋白翻譯起始，從而降低蛋白翻譯效率。Western Blotting實驗分析表明，在病毒感染12小時后，eIF2α激酶PKR的表達量上升，并被磷酸化激活；位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的eIF2α激酶PERK被磷酸化，并被剪切成兩個片段。藥物抑制實驗證明：抑制PKR的活性阻止了eIF2α的磷酸化，而抑制PERK活性對eIF2α的磷酸化沒有影響，說

7、明PKR識別病毒復制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA（dsRNA），介導了 eIF2α的磷酸化和抑制蛋白翻譯關(guān)閉。另外，eIF2α高磷酸化水平導致轉(zhuǎn)錄因子ATF4被優(yōu)先翻譯，進而上調(diào)表達eIF2α磷酸酶PP1的調(diào)節(jié)亞基GADD34。GADD34能夠與PP1結(jié)合，水解eIF2αSer51位點的磷酸基團。通過外源表達GADD34，我們證實了GADD34能夠降低eIF2α的磷酸化水平，并部分恢復蛋白翻譯效率，并有利于病毒蛋白的合成。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，在N