宮內(nèi)移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對胚胎期顯性脊柱裂胎鼠神經(jīng)元重建的研究.pdf

1、目的：
　　 神經(jīng)管缺陷（Neural tube defects，NTDs）是常見的先天性畸形之一，世界范圍內(nèi)發(fā)病率占總出生兒數(shù)的1/1000～9/1000，是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測的疾病之一，目前認(rèn)為神經(jīng)管缺陷是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，有家族遺傳傾向。胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)管發(fā)育缺陷可出現(xiàn)腦和脊髓畸形，其中腦裂和脊柱裂占所有類型的95％，脊柱裂根據(jù)椎管內(nèi)容物是否突出脊柱皮膚分為顯性脊柱裂和隱性脊柱裂。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的不斷

2、提高，越來越多的神經(jīng)管畸形在孕中期或孕早期被發(fā)現(xiàn)，但是產(chǎn)前治療方面的研究卻進(jìn)展緩慢，許多母親被迫選擇終止妊娠，出生后的神經(jīng)畸形患兒的致殘率和死亡率也較高。目前國內(nèi)外應(yīng)用胎兒外科技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前修補(bǔ)可以減少腦積水和腦疝的發(fā)生率，但對神經(jīng)功能的恢復(fù)仍不理想，下肢感覺運(yùn)動功能障礙和尿便障礙仍然是常見的術(shù)后并發(fā)癥。
　　 干細(xì)胞移植治療出生缺陷是目前較先進(jìn)的治療方法，宮內(nèi)移植的優(yōu)點包括：1.由于胎兒在宮內(nèi)生長發(fā)育快，因此為植入的干細(xì)胞生長繁

3、殖提供了有利時機(jī)；2.MSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后進(jìn)行自體移植，不存在免疫反應(yīng)，而且避免了社會倫理問題；3.能夠在疾病的早期得以及時治療。目前利用干細(xì)胞移植技術(shù)治療白血病及先天性免疫缺陷性疾病以有報道，但關(guān)于宮內(nèi)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)管畸形的報道卻很少。
　　 先天性神經(jīng)管發(fā)育畸形的治療一直是困擾國內(nèi)外學(xué)者的難題。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，先天性脊椎裂鼠支配肛門外括約肌和肛提肌的脊髓運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，說明脊柱裂的脊髓神經(jīng)元在胚胎期已經(jīng)存在明顯

4、發(fā)育異常。因此我們認(rèn)為在顯性脊椎裂患兒術(shù)后神經(jīng)功能恢復(fù)的治療中，神經(jīng)元的再生或修復(fù)才是最重要的治療原則。移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）可以轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞，這為先天性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的細(xì)胞替代治療提供了可能。因此本研究嘗試?yán)肕SCs進(jìn)行宮內(nèi)移植治療先天性脊椎裂，并對移植后干細(xì)胞的遷移和分化情況進(jìn)行評價，探索先天性脊椎裂的治療新方法。
　　 材料和方法：
　　 一、實驗動物
　　 1、原代培

5、養(yǎng)4周齡Wistar鼠40只，體重90-100g。由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。
　　 2、動物模型10-12周齡Wistar孕鼠100只，體重250-300g。
　　 二、方法
　　 1、原代培養(yǎng)及腺病毒-EGFP轉(zhuǎn)染：無菌條件下取大鼠骨髓用全骨髓貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，腺病毒-EGFP（MOI值300-500）轉(zhuǎn)染P0-P15代骨髓MSCs。
　　 2、胎鼠先天性脊椎裂動物模型的建立：孕

6、10進(jìn)行4％維甲酸（140mg/kg）胃管給藥，利用藥物致畸方法制作先天性脊椎裂動物模型。
　　 3、干細(xì)胞移植：利用胎仔外科方法將轉(zhuǎn)染EGFP的MSCs經(jīng)纖細(xì)玻璃針注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中，并存活至20天，剖宮取胎。
　　 4、冰凍連續(xù)切片計數(shù)移植細(xì)胞的存活數(shù)量：取20天先天性脊椎裂胎鼠的脊椎，固定脫水后做冰凍切片，計數(shù)脊髓中綠色熒光細(xì)胞數(shù)量及分布情況。
　　 5、免疫熒光方法檢測移植細(xì)胞的分化情況：免疫

7、熒光方法檢測脊髓冰凍切片中EGFP陽性MSCs中Nestin、NF、GFAP、Myod的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 一、細(xì)胞濃度
　　 流式細(xì)胞儀鑒定全骨髓細(xì)胞懸液貼壁法得到MSCs純度，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)時間越長，干細(xì)胞的純度越高。
　　 二、孕鼠及胎鼠存活率
　　 被移植孕鼠共86只，術(shù)后存活并得到脊柱裂標(biāo)本的孕鼠共81只，孕鼠存活率94％。每只孕鼠平均移植2-3只胎鼠，最后存活的胎鼠比例為78％。

8、
　　 三、細(xì)胞存活情況
　　 通過對實驗結(jié)果計數(shù)分析，移植MSCs的總存活率為24％。并且發(fā)現(xiàn)不同濃度MSCs、不同代數(shù)的MSCs和不同移植時間對MSCs存活率都有不同的影響：在孕16天、17天和18天時移植相同代數(shù)的MSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孕16天存活率明顯低于孕17和18天，（P＜0.05）；在相同移植時間（16天移植MSCs），P0代MSCs存活率最低，P3-6和P10-14代無明顯差別（P＞0.05）；移植MSCs細(xì)

9、胞數(shù)量不同對存活率影響不大（P＞0.05）。
　　 四、細(xì)胞分化情況
　　 免疫熒光法檢測MSCs移植到脊髓中分化情況，發(fā)現(xiàn)移植MSCs不僅分化為不同神經(jīng)細(xì)胞，包括神經(jīng)干細(xì)胞（Nestin）、神經(jīng)元（Neurofilamem）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）。而且可分化為肌原細(xì)胞（MyoD）。分化率在P10-14代MSCs明顯高于P3-6代MSCs，在16天移植明顯高于孕17天和18天（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：<