人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化神經(jīng)元樣細(xì)胞移植治療局灶性腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腦血管意外是世界范圍內(nèi)的三大死因之一，也是導(dǎo)致成人殘疾的首位病因。我國(guó)年發(fā)病率約130—300萬(wàn)，死亡60—100萬(wàn)，存活者中75%有不同程度的殘疾。盡管在腦血管意外的急救和早期康復(fù)方面取得了很大進(jìn)展，但對(duì)腦血管意外后期嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙缺乏有效的治療方法。21世紀(jì)是再生醫(yī)學(xué)的世紀(jì)，干細(xì)胞的研究則是當(dāng)前生命科學(xué)的重中之重。與胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞相比，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs具有以下優(yōu)點(diǎn)：①取材方便，分離獲取容易，可從自身骨髓

2、提??；②在體外擴(kuò)增迅速，具有多向分化潛能；③是來(lái)自中胚層的早期細(xì)胞，避免組織配型及免疫排斥等問(wèn)題；④可避免倫理學(xué)方面的爭(zhēng)議等。因此，受到越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注。但BMSCs移植后在體內(nèi)微環(huán)境下分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的比率較大而分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的比率較小，如果能將骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，再行細(xì)胞移植將會(huì)有事半功倍的效果。本研究擬探討體外分離培養(yǎng)、純化鑒定hBMSCs的方法，分析其生物學(xué)特性并定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并通過(guò)立體定

3、向?qū)BMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞植入腦缺血大鼠腦內(nèi)，觀察移植后細(xì)胞存活、遷移、分化以及大鼠的神經(jīng)功能障礙恢復(fù)情況，并與hBMSCs移植做一比較，探討hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞移植對(duì)于局灶性腦缺血后神經(jīng)功能缺失的修復(fù)作用及可能機(jī)制，以期為hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞移植治療腦缺血提供理論依據(jù)。 方法：⑴用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化hBMSCs，在體外觀察hBMSCs生長(zhǎng)特性、傳代擴(kuò)增，測(cè)定生長(zhǎng)曲線，形態(tài)學(xué)觀察，免疫細(xì)胞化

4、學(xué)及圖像分析測(cè)定細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況；⑵將其與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)3H—TdR摻入、β液閃計(jì)數(shù)，分析其免疫原性；⑶采用全反式維甲酸（ATRA）、叔丁對(duì)甲氧酚（BHA）等對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，繼而采用免疫細(xì)胞化學(xué)等方法對(duì)分化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定；⑷采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型。將腦缺血大鼠隨機(jī)分為磷酸鹽緩沖液（PBS）組、hBMSCs組及hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞組，分別將PBS、BrdU標(biāo)記的hBMSCs及BrdU標(biāo)記

5、的源性神經(jīng)元樣細(xì)胞通過(guò)立體定向植入大鼠紋狀體內(nèi)。術(shù)前、術(shù)后1、3、6及8周進(jìn)行神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分（NSS）、平衡木實(shí)驗(yàn)（BBT）、抬高身體搖擺實(shí)驗(yàn)（EBST）、一次性被動(dòng)回避平臺(tái)實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)，觀察各組術(shù)后神經(jīng)功能改變情況；8周后處死大鼠取腦，HE染色、BrdU免疫組化染色以及BrdU/NSE，BrdU/GFAP免疫組化雙染，觀察植入BMSCs的存活、遷移、分化情況。 結(jié)果：①hBMSCs在體外可以大量增殖，原代培養(yǎng)需要2～

6、3周，傳代后速度加快，可以獲取大量貼壁細(xì)胞。細(xì)胞呈均一的成纖維細(xì)胞樣，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs的表面抗原，均一表達(dá)CD29、CD44和CD105，不表達(dá)CD34、CD45、CD19、HLA—DR和CD106；②與T淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)，無(wú)明顯的促T細(xì)胞增殖反應(yīng)，提示其具有低免疫原性的特點(diǎn)；③可誘導(dǎo)表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志抗原神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志抗原膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）；④應(yīng)用線栓法短暫閉塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈后，

7、大鼠出現(xiàn)左側(cè)肢體不同程度偏癱同時(shí)伴有右側(cè)Honner氏征。TTC和HE染色均顯示缺血區(qū)域位于右側(cè)紋狀體、額頂區(qū)皮層，位置和范圍較為穩(wěn)定；神經(jīng)功能行為學(xué)檢測(cè)顯示：hBMSCs移植大鼠NSS、BBT、EBST在術(shù)后1、3、6、8周與PBS對(duì)照組比較有顯著好轉(zhuǎn)（P<0．01），在術(shù)后1、3周與hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞移植組比較有好轉(zhuǎn)（P<0．05），6、8周NSS、BBT、EBST評(píng)分兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．05）；hBMSCs源性

8、神經(jīng)元樣細(xì)胞移植組大鼠NSS、BBT、EBST在術(shù)后3、6、8周較PBS對(duì)照組明顯改善（P<0．01），在術(shù)后1、3周較hBMSCs移植組差（P<0．05），6、8周NSS、BBT、EBST評(píng)分兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．05）；hBMSCs和hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞組較對(duì)照組一次性被動(dòng)回避平臺(tái)實(shí)驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)明顯改善（P<0．01）；hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞較hBMSCs組效果更好（P<0．05）。移植8周后，hBMSCs組

9、和hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞組均可見較多BrdU表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，細(xì)胞集中在移植位點(diǎn)及周圍區(qū)域，有向缺血灶遷移的趨勢(shì)，局部無(wú)膠質(zhì)增生和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，hBMSCs組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞群中，11．5—19．3%為GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，1．5—4．8%為NSE陽(yáng)性細(xì)胞，hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞群中，23．5—39．1%為NSE陽(yáng)性細(xì)胞，9．8—17．6%為GFAP陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論：hBMSCs屬骨髓中單個(gè)核細(xì)胞，具有免

10、疫原性低、可塑性好和擴(kuò)增能力強(qiáng)等特性，密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法能有效分離純化hBMSCs；全反式維甲酸（ATRA）、叔丁對(duì)甲氧酚（BHA）等對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，可誘導(dǎo)表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志抗原神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞；hBMSCs和hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞腦內(nèi)移植均能有效改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能癥狀，hBMSCs移植作用起效更快，hBMSCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞移植在學(xué)習(xí)、記憶功能方面