轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞在先天性脊椎裂胎鼠中的分布和分化.pdf

1、目的：
　　 神經(jīng)管發(fā)育畸形是除心臟畸形以外的最常見的先天性畸形之一,世界范圍內(nèi)占出生嬰兒總數(shù)的1/1000-9/1000。神經(jīng)管畸形是由于胚胎發(fā)育早期神經(jīng)褶的融合異常所致,以脊椎裂最為常見。先天性脊椎裂常發(fā)生在腰骶部,多伴有嚴重的尿、便失禁和下肢活動障礙。研究發(fā)現(xiàn),先天性脊椎裂鼠支配肛門外括約肌和肛提肌的脊髓運動和感覺神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。因此利用骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)在體內(nèi)具有向神經(jīng)細胞分化的潛能,進行神經(jīng)元的修復或替代治

2、療為該病提供了一個新的治療思路。
　　 MSC是一種具有自我增殖和多向分化潛能的成體干細胞,它遺傳背景穩(wěn)定,可在體外培養(yǎng)、擴增及誘導。目前,它已被分化誘導為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、肌細胞等多種細胞,是組織工程中具有廣闊前景的一類種子細胞。利用MSC進行細胞學和組織工程學研究,有以下優(yōu)點:①取材方便;②可在培養(yǎng)基中快速擴增;③MSC經(jīng)誘導分化后進行自體移植,不存在免疫反應,而且避免了社會倫理問題;④在宿主組織中可長

3、期生存并分化;⑤可表達導入的外源基因。因此,MSC是一種理想的細胞來源,為疾病的細胞治療和基因治療帶來了新的希望。
　　 本實驗對骨髓MSC進行體外培養(yǎng)、擴增,用帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的腺病毒轉(zhuǎn)染,并建立先天性脊椎裂胎鼠模型,將轉(zhuǎn)染的MSC移植入胎鼠體內(nèi),觀察MSC在胎鼠脊髓中的存活、分布及分化情況,為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 1、實驗動物
　　 (1)原代培養(yǎng)

4、　　 普通級4周齡Wistar鼠40只,雌雄不限,體重90-100g。由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。
　　 (2)動物模型
　　 普通級孕10天Wistar鼠61只,分為致畸組41只(孕17天21只,孕18天20只)和對照組20只。
　　 2、方法
　　 (1)原代培養(yǎng)
　　 無菌條件下取大鼠骨髓用貼壁培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng),0.4％臺盼蘭染色測定細胞活力,流式細胞儀進行CD34、CD

5、44和CD90表型鑒定。
　　 (2)轉(zhuǎn)染
　　 腺病毒-EGFP(MOI值300-500)轉(zhuǎn)染P2或P3代骨髓MSC,流式細胞儀鑒定MSC的轉(zhuǎn)染率。
　　 (3)建立胎鼠先天性脊椎裂動物模型
　　 致畸組孕10天予4％維甲酸(140mg/kg)胃管給藥,對照組予等量橄欖油。孕17天或18天時,觀察胎鼠外觀并記錄顯性脊椎裂等先天畸形的發(fā)生率,進行細胞移植。
　　 (4)細胞移植
　　 將轉(zhuǎn)

6、染EGFP的MSC經(jīng)纖細玻璃針注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中,修復孕鼠子宮、關(guān)腹,孕鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至20天。
　　 (5)移植細胞的存活及分布情況
　　 取20天先天性脊椎裂胎鼠的脊椎,固定脫水后做連續(xù)冰凍切片,計數(shù)脊髓中綠色熒光細胞數(shù)。
　　 (6)移植細胞的分化
　　 免疫熒光方法檢測EGFP陽性MSC中巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的分布與表達。

7、r>　　 結(jié)果：
　　 1、骨髓MSC原代培養(yǎng)5.7天可傳代,0.4％臺盼蘭染色細胞活力為97％-98％。傳代后細胞增殖加快,4.5天可傳代。MSC每傳一代細胞數(shù)增加3-4倍。
　　 2、流式細胞儀鑒定結(jié)果顯示MSC不表達CD34,87％表達CD44,98％表達CD90。
　　 3、腺病毒-EGFP轉(zhuǎn)染骨髓MSC的轉(zhuǎn)染率為40％。
　　 4、致畸組共獲得胎鼠253只,先天性顯性脊椎裂胎鼠163只,致畸率

8、64.4％。對照組未見畸形胎鼠。
　　 5、細胞移植后,共獲得先天性顯性脊椎裂鼠脊髓83個,其中帶有EGFP-MSC陽性脊髓27個。每個脊髓中EGFP陽性細胞數(shù)多少不等,66-735個。孕17天或孕18天進行細胞移植,脊髓內(nèi)存活MSC數(shù)量在兩組之間無顯著性差異(P＞0.05)。移植的MSC存在于脊髓表面或進入脊髓中,可分化為不同形狀的細胞。
　　 6、免疫熒光法證實移植到脊髓中的MSC可表達神經(jīng)干細胞的標志物nestin

9、和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標志物GFAP。
　　 結(jié)論：
　　 1、貼壁培養(yǎng)法是分離骨髓MSC的簡單易行方法,傳代后細胞增殖迅速,純度高,可滿足實驗需要。
　　 2、腺病毒載體介導EGFP基因?qū)τ贛SC具有較高的轉(zhuǎn)染率,不影響細胞的存活與分化,是研究MSC移植的理想示蹤方法。
　　 3、過量維甲酸可以建立穩(wěn)定的先天性顯性脊椎裂動物模型。
　　 4、帶有EGFP的MSC經(jīng)細胞移植后能在胎鼠脊髓內(nèi)存活,并可以分