胚胎期和生后不同脊髓微環(huán)境對骨髓間充質干細胞分化影響及RNAi沉默CRMP-4對先天性脊柱裂治療的研究.pdf

1、目的:
　　神經管畸形(Neural tube defects，NTDs)是最常見、最嚴重的中樞神經系統(tǒng)先天性畸形，發(fā)生率為0.5‰-20‰。目前神經管畸形在治療方面尚無突破性進展。腦積水、下肢功能障礙以及尿便失禁是嚴重的術后神經系統(tǒng)后遺癥，這主要是由于神經損傷后修復極其困難造成的。隨著干細胞研究的不斷深入，為神經系統(tǒng)損傷的修復與重建帶來了美好的應用前景。在個體發(fā)育過程中，各種類型的神經細胞是通過多向分化潛能干細胞逐漸分化而來，這

2、一分化過程受到細胞內外環(huán)境的調節(jié)。脊髓微環(huán)境是一個復雜的綜合系統(tǒng)，其中各種細胞因子以及細胞外信號系統(tǒng)對細胞的遷移分化有著重要作用。因此，本研究建立在胚胎期和出生后不同時期移植MSCs的動物模型，比較不同脊髓微環(huán)境中骨髓間充質干細胞的分化率變化情況，并進一步探討不同因子（神經營養(yǎng)因子和生長因子等）在不同脊髓微環(huán)境中表達規(guī)律及其對MSCs分化的影響，探討不同脊髓微環(huán)境對干細胞分化的影響機制，為建立神經管畸形治療新方法提供前期基礎。
　

3、　我們前期研究發(fā)現(xiàn)在先天性脊柱裂鼠的體內移植的MSCs，雖然可以存活，但細胞成活率較低。因此，我們設想可能在先天性脊柱裂鼠脊髓微環(huán)境中存在一些有害因子，這些有害因子不僅能夠引起脊髓本身的神經細胞死亡而導致脊髓發(fā)育不良，而且能夠引起移植干細胞死亡而導致成活率較低。我們利用雙向電泳和質譜分析的方法，對先天性脊柱裂鼠的局部脊髓組織和相應階段的正常脊髓組織的蛋白質表達譜進行了對比分析，首次發(fā)現(xiàn)CRMP-4在先天性脊柱裂鼠的脊髓組織中存在異常高表

4、達。CRMPs(Collapsin response mediator proteins)家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的參與神經元細胞極化和突起生長的重要分子，已引起人們的高度重視。有研究證明CRMP-4的高表達與神經元凋亡有關。病理狀態(tài)下CRMP-4異常高表達是引起神經元死亡，并最終導致神經損傷修復困難的主要原因。因此，應用CRMP-4 RNAi病毒載體治療先天性脊柱裂，可以減少脊髓組織本身的神經元凋亡并促進突觸再生，同時改善脊髓的微環(huán)境，為先

5、天性脊柱裂胎兒提供一種針對病因治療的新方法。
　　方法:
　　1、間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)分離培養(yǎng)及腺病毒-eGFP轉染
　　取體重100g的Wistar大鼠，無菌條件下取股骨，用20ml含10％胎牛血清的培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，制作骨髓細胞懸液，應用全骨髓貼壁法分離骨髓間充質干細胞，5％CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。
　　綠色熒光蛋白標記骨髓間充質干細胞，轉染腺

6、病毒-5F35-enhanced GeneFluorescent Protein(eGFP)，16h后熒光顯微鏡下確定綠色熒光蛋白表達情況，計數(shù)eGFP陽性細胞數(shù)。
　　2、動物模型建立及標本收集
　　成熟未孕Wistar大鼠雌雄比例5∶1午夜合籠，次日晨8-9時陰道涂片，顯微鏡下見到精子記為孕0天(Embryonic day0，E0)。
　　移植MSCs及脊髓標本收集:利用胎仔外科和顯微注射相結合技術建立動物模型，胚

7、胎期:在Wistar孕鼠妊娠第16天，麻醉后，進行胎鼠顯微外科手術，對3-5只胚胎進行腰骶段脊髓內注射轉染eGFP的MSCs。在顯微鏡下打開子宮壁，暴露胎鼠腰骶段脊髓，用微量注射器將骨髓間充質干細胞緩慢注入胎鼠脊髓組織內，然后分層縫合子宮壁和腹壁，待孕鼠清醒后放回籠內喂養(yǎng)。出生后:分別在Wistar鼠出生后1天，21天時進行MSCs移植。將鼠麻醉后，固定在鼠板上，以棘突為中心取背部后正中切口，顯露脊髓組織后，用微量注射器將轉染eGFP的

8、MSCs緩慢注入新生鼠的脊髓組織內，逐層縫合，待鼠清醒后放回籠內喂養(yǎng)。對照組應用同樣方法給予同等劑量的培養(yǎng)基。在移植后4天取材，4％多聚甲醛固定或取出胎鼠脊髓，-80℃保存。
　　不同發(fā)育階段脊髓標本收集:解剖顯微鏡下分別于E12，E14，E16，E18，E20，P1，P3，P5，P7，P14，P21取出鼠脊髓，-80℃保存。
　　3、細胞分化的免疫熒光染色分析
　　連續(xù)冰凍切片，并計數(shù)移植的MSCs存活數(shù)量及分布情況

9、。應用免疫熒光染色方法檢測移植的MSCs分化情況，將冰凍切片置于甲醇中二次固定，進行抗原修復，10％血清封閉，加一抗、4℃過夜，加羅丹明或488標記的熒光二抗，DAPI染核。鏡下觀察，激光共聚焦顯微鏡采集結果圖像，分析移植的MSCs表達Nestin、GFAP、Tublin的情況。
　　4、熒光定量PCR檢測移植MSCs后和不同發(fā)育階段正常脊髓組織中神經營養(yǎng)因子和生長因子的表達。
　　提取脊髓組織中的總RNA，進行反轉錄為cD

10、NA，然后進行Real-time PCR反應。調整cDNA濃度為500ng/μl，20μl反應體系，反應條件為:Stage1預變性:95℃-30sec; Stage2 PCR反應:95℃-5sec，60℃-30sec，40個循環(huán);Stage3融解曲線分析:95℃-10sec，60℃-15sec，95℃-20sec。每個樣本行3個平行孔重復實驗，采用2-△△Ct的方法分析目的基因的相對表達量。
　　5、CRMP-4 RNAi載體篩選

11、、構建及干擾效果驗證
　　通過http://genecopoeia.biomart.cn網站設計大鼠CRMP-4的shRNA序列，并構建質粒載體。將構建的4種質粒載體分別轉染原代培養(yǎng)的大鼠神經干細胞，然后利用Westen-blot的方法，篩選出干擾效果最好的質粒載體。
　　構建CRMP-4 RNAi腺病毒載體，轉染體外培養(yǎng)的原代培養(yǎng)的大鼠神經于細胞，然后利用熒光定量PCR、Western-blot的方法，在體內外驗證干擾效果

12、。
　　提取脊髓組織中的總RNA，進行反轉錄為cDNA，然后進行Real-time PCR反應。調整cDNA濃度為500ng/μl，20μl反應體系，反應條件為:Stage1預變性:95℃-30sec; Stage2 PCR反應:95℃-5sec，60℃-30sec，40個循環(huán);Stage3融解曲線分析:95℃-10sec，60℃-15sec，95℃-20sec。每個樣本行3個平行孔重復實驗，采用2-△△Ct的方法分析目的基因的相

13、對表達量。
　　取50μg蛋白的樣品溶液上樣，恒流電泳15mA/膠，2小時;將電泳后的膠按照8層濾紙-PVDF膜-凝膠-8層濾紙順序制作轉膜三明治，恒流1mA/cm2，1小時轉膜;將PVDF膜常溫封閉2小時;加一抗，4℃過夜;加二抗，室溫2小時;ECL顯示條帶，采集圖像并分析。
　　6、脊柱裂模型制作，胎仔外科和顯微外科相結合進行CRMP-4RNAi腺病毒載體治療
　　孕鼠E10時經胃管灌入維甲酸（150mg/kg，橄

14、欖油將atRA溶解成40mg/ml的混懸液）。E16時將孕鼠麻醉，打開腹腔，暴露子宮，在顯微鏡下打開子宮壁，然后利用顯微注射器將CRMP-4 RNAi腺病毒載體注射入先天性脊柱裂胎鼠的脊髓缺損部位（注入量:0.5μl），對照組應用同種方法注射同等劑量的eGFP腺病毒載體，逐層關腹，待孕鼠麻醉清醒后放回籠內喂養(yǎng)。于移植后4天取材，-80℃保存。
　　結果:
　　1、細胞分離培養(yǎng)及轉染情況
　　經流式細胞儀鑒定全骨髓細胞懸

15、液貼壁法分離培養(yǎng)的MSCs，其純度達90％以上，eGFP轉染率達70％。
　　2、胎鼠及出生后鼠的存活情況
　　本研究成功建立動物模型，進行顯微外科手術，繼續(xù)喂養(yǎng)4天后取材，熒光顯微鏡下可見MSCs在不同發(fā)育階段脊髓組織中均有存活。顯微注射MSCs胎鼠(E16)共102只，術后存活并得到脊髓標本的胎鼠共86只，存活率84％。出生后1天顯微注射MSCs新生鼠82只，術后存活并得到脊髓標本的鼠共68只，存活率82.9％。出生后2

16、1天顯微注射MSCs新生鼠54只，術后存活并得到脊髓標本的鼠共49只，存活率90.7％。
　　3、細胞分化免疫熒光染色結果
　　不同發(fā)育階段脊髓中移植的MSCs均有存活，并可分化為不同的神經細胞，移植的MSCs表達神經特異性標記物nestin(神經前體細胞)、GPAP(神經膠質細胞)及tubulin(神經元)。胚胎期移植的MSCs分化率明顯高于出生后1天和21天(P＜0.05)。
　　結論:
　　1、不同發(fā)育階段

17、的脊髓微環(huán)境中移植MSCs存活并分化為神經干細胞、神經元、神經膠質細胞，并且胚胎期移植的MSCs的分化率明顯高于出生后。
　　2、移植MSCs后，不同發(fā)育階段的脊髓微環(huán)境中神經營養(yǎng)因子和生長因子明顯升高，同時神經營養(yǎng)因子和生長因子的表達量與MSCs的數(shù)量成正相關。
　　3、不同發(fā)育階段的脊髓微環(huán)境中神經營養(yǎng)因子和生長因子的表達量不同，胚胎期脊髓微環(huán)境更有利于MSCs存活和分化為神經細胞。
　　4、成功構建CRMP-4