人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不同膜免疫分子動(dòng)態(tài)表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)檢測(cè)體外誘生培養(yǎng)過(guò)程中人外周血淋巴細(xì)胞表面幾種白介素受體(IL-R)、共刺激分子和凋亡受體/配體的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，以及細(xì)胞周期的變化，初步探討人T細(xì)胞在體外誘生培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞因子的需求狀況及其與T細(xì)胞活化增殖和凋亡的關(guān)系，從而為試驗(yàn)研制復(fù)合優(yōu)化的T細(xì)胞條件培養(yǎng)基提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：采用Ficoll密度梯度離心結(jié)合培養(yǎng)皿貼附法，無(wú)菌分離人外周血淋巴細(xì)胞，置不同培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)；用免疫熒光、免疫酶染色結(jié)合細(xì)胞

2、ELISA(CELISA)法，于不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(0、1、3、5、7、9、11、14d)動(dòng)態(tài)觀測(cè)白介素受體IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-7R、IL-12R、IL-18R，共刺激分子CD27、CD28、4-1BB，凋亡相關(guān)分子CD95(Fas)、CD178(FasL)的表達(dá)情況；以臺(tái)盼藍(lán)染色法同步觀測(cè)各培養(yǎng)組的死、活細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線；并于培養(yǎng)第3天采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，采用流式細(xì)胞儀(FCM)分析各培養(yǎng)組細(xì)

3、胞周期的變化。 結(jié)果：1.不同培養(yǎng)條件下淋巴細(xì)胞表面幾種免疫相關(guān)分子動(dòng)態(tài)表達(dá) (1)培養(yǎng)前不同免疫相關(guān)分子的表達(dá)水平 IL-2Rγ表達(dá)較高，其次為4-1BB和IL-3R，而IL-1Rα、IL-2Rα、IL-7R、IL-12R、IL-18R、CD27、CD28、Fas和FasL表達(dá)較低。免疫染色觀察和CELISA檢測(cè)結(jié)果一致。 (2)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)免疫相關(guān)分子的表達(dá)變化 5％FBSRPMI1640培

4、養(yǎng)組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)1640組)：IL-1Rα在培養(yǎng)第1天仍表達(dá)較低，第3天表達(dá)較高，以后各天變化不大；IL-2Rα的表達(dá)于第1天即增強(qiáng)，到第11天仍表達(dá)較高，第14天表達(dá)減弱；IL-2Rγ一直表達(dá)較高，培養(yǎng)后呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)；IL-3R于第3天表達(dá)增強(qiáng)，以后持續(xù)表達(dá)較高；IL-7R的表達(dá)在第3～7天較高，第9天后表達(dá)漸弱；IL-12R于第3～5天表達(dá)較強(qiáng)，第7天即下降；IL-18R于第5天才表達(dá)增強(qiáng)，至第14天維持較高表達(dá)；CD28在第1

5、～7天表達(dá)較高，第9天后逐漸下調(diào)；CD27于第5天才表達(dá)漸強(qiáng)，后持續(xù)較高表達(dá)；4-1BB的表達(dá)于第1～7天進(jìn)一步增強(qiáng)，第9天后下降；Fas的表達(dá)在第1～9天呈持續(xù)上升趨勢(shì)，第11天達(dá)高峰，第14天下降。FasL于第1天即表達(dá)增強(qiáng)，第7天達(dá)高峰，第9天后下調(diào)，但仍維持較高表達(dá)水平。 1640+IL-2培養(yǎng)組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)IL-2組)：總的看來(lái)，IL-2組培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞各免疫相關(guān)分子的表達(dá)分別較強(qiáng)于1640組，但較1640+PHA組為低

6、。培養(yǎng)第1天，IL-1Rα表達(dá)更弱，IL-3R、IL-7R、IL-12R、IL-18R、CD28、Fas和FasL表達(dá)增強(qiáng)；第3天，IL-1Rα、IL-2Rα、IL-2Rγ、CD27、4-1BB表達(dá)增強(qiáng)；5～7天時(shí)，IL-2Rα和IL-2γ的表達(dá)進(jìn)一步增高達(dá)峰值，而IL-12R、IL-18R和Fas有所下調(diào)；9～14天，除CD27維持較高表達(dá)外，其余分子的表達(dá)均呈下調(diào)趨勢(shì)。 1640+PHA培養(yǎng)組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)PHA組)：三種培養(yǎng)條

7、件中，以PHA組培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞其免疫分子表達(dá)最高，表達(dá)趨勢(shì)略有不同。培養(yǎng)第1天，多數(shù)免疫分子的表達(dá)增強(qiáng)，CD27、4-1BB變化不大；第3天，CD27、4-1BB表達(dá)增高，IL-2Rγ、IL-18R、CD28、Fas、FasL達(dá)峰值，其余分子也維持較高表達(dá)；5～7天，IL-12R、CD28的表達(dá)開(kāi)始減低；9～11天，IL-2R、IL-7R、18R、Fas和FasL的表達(dá)下降；至14天時(shí)，IL-1Rα、IL-3R、CD27、4-1BB的表

8、達(dá)仍較高，而多數(shù)免疫分子的表達(dá)則呈下調(diào)趨勢(shì)。 2.不同培養(yǎng)條件下人血淋巴細(xì)胞的增殖情況 (1)MTT試驗(yàn) 培養(yǎng)第3天，IL-2組培養(yǎng)的細(xì)胞所形成的甲臢顆粒及其OD490值略高于1640組；PHA組、CD3McAb+IL2組、CD3McAb+CD28McAb+IL2組、CD3McAb+CD28McAb+IL2+IL1α組，其細(xì)胞增殖成團(tuán)，甲臢顆粒融成片狀，OD490值均顯著高于1640組和IL-2組；CD3McAb

9、+IL2組、CD3McAb+CD28McAb+IL2組、CD3McAb+CD28McAb+IL2+IL1α組分別與PHA組比較，CD3McAb+IL2組的OD490值低于PHA組，而后兩組的OD490值與PHA組無(wú)顯著差異。結(jié)合培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)及各組細(xì)胞增殖曲線，可以看出，CD3McAb+CD28McAb+IL2+IL1α組具有較強(qiáng)的增殖活力。 (2)生長(zhǎng)曲線的增殖倍數(shù) 不同組別培養(yǎng)的細(xì)胞隨時(shí)間呈不同程度的持續(xù)增殖狀態(tài)，在1

10、7天左右達(dá)增殖高峰。在培養(yǎng)第17天時(shí)，PHA組細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)121.447±11.488倍；CD3McAb+IL-2組與CD3McAb+CD28McAb+IL2組，擴(kuò)增倍數(shù)分別為106.873±12.413倍和137.877±14.472倍，其增殖倍數(shù)與PHA組比較無(wú)明顯差異；而CD3McAb+CD28McAb+IL2+IL1α組，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)在第17天時(shí)達(dá)151.497±20.378倍，其增殖倍數(shù)大于PHA組。 結(jié)論1.淋巴細(xì)

11、胞在體外誘生培養(yǎng)前和培養(yǎng)后不同時(shí)間幾種白介素受體、共刺激分子及凋亡相關(guān)分子的表達(dá)存在動(dòng)態(tài)變化。總體表達(dá)趨勢(shì)為培養(yǎng)第1～3天表達(dá)增強(qiáng)、5～7天達(dá)高峰、9～14天逐漸降低；表達(dá)強(qiáng)度依次為PHA組、IL-2組、1640組；PHA組培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞各種膜免疫分子表達(dá)峰值的時(shí)間明顯前移。結(jié)果反映了體外培養(yǎng)過(guò)程中淋巴細(xì)胞的復(fù)合生長(zhǎng)因子需求、增殖活性及凋亡狀況，為試驗(yàn)研制復(fù)合優(yōu)化的T細(xì)胞條件培養(yǎng)基提供了實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。 2.T淋巴細(xì)胞體外復(fù)合誘生

12、培養(yǎng)方法初步探索的試驗(yàn)結(jié)果提示：CD3McAb+CD28McAb+IL2+IL1α的復(fù)合培養(yǎng)基配方優(yōu)于單獨(dú)IL-2、CD3McAb+IL2、CD3McAb+CD28McAb+IL2組合的刺激，接近甚至優(yōu)于PHA刺激。該組配方，或再結(jié)合其它細(xì)胞因子或PHA，可能在體外大量誘生培養(yǎng)T細(xì)胞/腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)轉(zhuǎn)而用于腫瘤過(guò)繼細(xì)胞免疫治療方面具有應(yīng)用前景。 3.CELISA的改建方法，簡(jiǎn)便可行且無(wú)放射性污染，可望能作為一種大規(guī)模