黏附分子在生殖道黏膜免疫淋巴細胞歸巢過程中的作用.pdf

1、黏膜免疫系統(tǒng)(mucosal immune system，MIS)-----指廣泛分布于呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺體處的淋巴組織，在結(jié)構(gòu)和功能上均有別于系統(tǒng)性免疫系統(tǒng)。黏膜免疫系統(tǒng)中的黏膜相關淋巴組織(mucosal associatedlymphoid tissues，MALT)包括:腸相關淋巴組織(GALT)、支氣管相關淋巴組織(BALT)、鼻相關淋巴組織(NALT)以及泌尿生殖道黏膜相關淋巴組織等。MALT中的

2、淋巴細胞主要是在黏膜淋巴系統(tǒng)內(nèi)進行再循環(huán)，這與其表達的歸巢分子有關。MIS按功能不同可分為誘導部位和效應部位。在誘導部位和效應部位之間，主要通過淋巴細胞歸巢發(fā)生聯(lián)系。從黏膜誘導部位歸巢到效應部位這一功能上相關聯(lián)的系統(tǒng)統(tǒng)稱為共同黏膜免疫系統(tǒng)(common mucosal immune system)。共同黏膜免疫系統(tǒng)在黏膜免疫中有共同的效應，但對不同部位的黏膜，其免疫機制又有各自的特殊性，這與各器官的解剖和功能不同有關。在黏膜免疫機制的研

3、究中，胃腸道黏膜免疫系統(tǒng)研究較深入。女性生殖道是一個特殊的黏膜免疫系統(tǒng)同時又有內(nèi)分泌功能，所以生殖道黏膜免疫更為復雜。近幾年生殖道黏膜免疫系統(tǒng)的作用也慢慢被大家所關注。我們實驗室前期成功構(gòu)建了分泌hCGβ及攜分子佐劑C3d3的hCGβ-C3d3融合蛋白重組乳酸桿，并已研究證明，通過黏膜接種BALB/c小鼠，能產(chǎn)生抗hCGβ體液免疫應答，但是對于這些參與免疫反應的淋巴細胞是如何歸巢及居留在生殖道的研究還很少。因此本實驗著重于研究生殖道黏膜

4、免疫后淋巴細胞歸巢相關粘附分子的表達及生殖道局部微環(huán)境對淋巴細胞歸巢的影響向，解析生殖道黏膜免疫的部分機制。
　　第一部分陰道黏膜免疫后淋巴細胞歸巢相關黏附分子的表達
　　目的:探討經(jīng)野生型及重組乳酸桿菌疫苗經(jīng)陰道黏膜接種BALB/c小鼠后淋巴細胞歸巢相關黏附分子的表達
　　方法:用磷酸鹽緩沖液(PBS)，野生型乳酸桿菌(Lb.)及重組乳酸桿菌（Lb.hCGβ和Lb.hCGβ-C3d3）以1010劑量(50ul)經(jīng)陰道

5、滴注接種6～8周齡雌性BALB/c小鼠，每組10只。3周后用相同劑量加強免疫一次。加強免疫2周末處死小鼠，取各組子宮及陰道。部分標本放入液氮儲存，待組織RNA提取，行實時定量PCR檢測黏附分子基因表達水平和組織蛋白提取，行Western Blot實驗，進行蛋白定量。部分標本用4％多聚甲醛固定24h，石蠟包埋，切片（厚度5μm），行免疫組織化學染色對黏附分子的表達進行定位。另外應用流式細胞術檢測各免疫組生殖道局部淋巴細胞表面黏附分子配體的

6、表達。
　　結(jié)果:加強免疫后，生殖道黏膜黏附分子的表達發(fā)生改變，黏附分子E-selectin，ICAM, VCAM, VAP-1 and E-cadherin均可以在基因和蛋白水平檢測到表達。并且絕大部分黏附分子在重組乳酸桿菌免疫后的子宮表達量增加。
　　結(jié)論:黏附分子E-selectin，ICAM，VCAM，VAP-1 and E-cadherin參與了生殖道局部淋巴細胞的歸巢。
　　第二部分生殖道粘膜免疫中歸巢淋巴

7、細胞表面高表達黏附分子相應配體的表達
　　目的:探討經(jīng)野生型及重組乳酸桿菌疫苗經(jīng)陰道黏膜接種BALB/c小鼠后淋巴細胞歸巢相關黏附分子配體的表達
　　方法:用磷酸鹽緩沖液(PBS)，野生型乳酸桿菌（Lb.）及重組乳酸桿菌（Lb.辦CGβ和Lb.hCGβ-C3d3）以1010劑量(50ul)經(jīng)陰道滴注接種6～8周齡雌性BALB/c小鼠，每組10只。3周后用相同劑量加強免疫一次。加強免疫2周末處死小鼠，取各組子宮及陰道。原代分離

8、出脾臟及生殖道局部淋巴細胞應用流式細胞術檢測各免疫組生殖道局部淋巴細胞表面黏附分子配體的表達。應用ELISA檢測各實驗組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1量的表達。
　　結(jié)果:分子佐劑C3d3能夠顯著的增加生殖道淋巴細胞歸巢相關黏附分子配體αEβ7，α4β7，LFA-1，VLA-4，PSGL-1的表達。
　　結(jié)論:加強免疫之后，分子佐劑C3d3可以增加黏附分子配體αEβ7，α4β7，LFA-1，VLA-4，PSGL-1的

9、表達，促進生殖道局部T，B淋巴細胞的歸巢。加強免疫之后，重組乳酸桿菌免疫組可以顯著促進子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞TGF-β1的表達。
　　第三部分陰道黏膜免疫后局部微環(huán)境對淋巴細胞歸巢的影響
　　目的:探討各免疫組加強免疫后，生殖道局部微環(huán)境對淋巴細胞歸巢的影響。
　　方法:用磷酸鹽緩沖液(PBS)，野生型乳酸桿菌（Lb.）及重組乳酸桿菌（Lb.hCGβ和Lb.hCGβ-C3d3）以1010劑量(50ul)經(jīng)陰道滴注接種6～8周

10、齡雌性BALB/c小鼠，每組10只。3周后用相同劑量加強免疫一次。加強免疫2周末處死小鼠，無菌條件下取出各組子宮及陰道。原代分離子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，收集培養(yǎng)上清，將各組培養(yǎng)上清種transwell小室的下室(600ul)，上室種各免疫組脾臟淋巴細胞(1×106/100ul)，37℃培養(yǎng)4h，收集遷移到下室的淋巴細胞經(jīng)流式細胞術檢測遷移至下室淋巴細胞的數(shù)量和淋巴細胞的比例。另外應用流式細胞術檢測各免疫組脾臟及生殖道T淋巴細胞表型的改變。