瘦素、BDNF及其受體(Trk B)在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)與生物學(xué)意義.pdf

1、目的：結(jié)直腸癌是一種“現(xiàn)代病”-與現(xiàn)代生活方式和飲食類型有關(guān)。大量流行病學(xué)，特別是移民流行病學(xué)研究顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病與能量攝入過多、肥胖、體力活動減少有關(guān)。就病因?qū)W而言，起決定作用的因素是環(huán)境因素而非遺傳因素，結(jié)直腸癌是一個生活方式相關(guān)癌。在發(fā)展中國家，人們越來越多的采用與癌相關(guān)的生活方式包括體力活動減少，飲食“西方化”導(dǎo)致的肥胖是結(jié)直腸癌發(fā)病率快速上升的重要原因。據(jù)預(yù)測，我國的結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率在今后很長一段時期內(nèi)將穩(wěn)步上升，成

2、為最常見、發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一。脂肪組織分泌雌激素、胰島素和胰島素樣生長因子，還分泌不同的生物活性物質(zhì)，稱作脂肪因子，其中最引人注目的是瘦素(Leptin)和脂聯(lián)素(Adiponectin)。下丘腦分泌的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( Brain-derived neurotrophic factors，BDNF)作用于白色脂肪組織調(diào)節(jié)瘦素的合成和分泌，稱為BDNF/Leptin軸，酪氨酸激酶受體B(Tyrosine kinase rec

3、eptor B，Trk B)是BDNF的特異性受體。瘦素的血清濃度與身體脂肪總量和總體重直接相關(guān)。我們的前期實驗針對瘦素、瘦素受體在結(jié)直腸癌組織和正常腸管組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)瘦素和瘦素受體與結(jié)直腸癌密切相關(guān)。本研究采用Western blot的方法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1中瘦素和BDNF的表達(dá)，進(jìn)一步分析瘦素和BDNF與結(jié)直腸癌的關(guān)系，同時用酶標(biāo)儀MTT法觀測瘦素和BDNF與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖生長的關(guān)系，探討可能影響結(jié)直腸癌

4、發(fā)生、發(fā)展的因素，試圖為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新的方法和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1和正常人腸上皮細(xì)胞株HIEC均由中山大學(xué)腫瘤防治中心（華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室）贈送。將其置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)液，顯微鏡動態(tài)觀察細(xì)胞生長情況，及時傳代培養(yǎng)。
　　 2.蛋白免疫印跡Western blot的方法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-

5、1和正常腸上皮細(xì)胞株HIEC中瘦素、BDNF和Trk B蛋白的表達(dá)情況。首先用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，獲取蛋白提取液，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。其次將蛋白提取液SDS-PAGE電泳，目的是根據(jù)分子量大小不同從蛋白提取液中分離出目的蛋白。再次，電轉(zhuǎn)儀中將凝膠上目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，PVDF膜封閉后與相應(yīng)一抗抗體充分孵育，抗原和抗體特異性結(jié)合反應(yīng)。二抗經(jīng)過辣根過氧化物酶偶聯(lián)標(biāo)記，識別結(jié)合一抗后與發(fā)光液接觸可發(fā)出熒光。最后

6、X光片壓片、曝光、洗片和顯影。
　　 3.酶標(biāo)儀MTT法檢測瘦素和BDNF對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖生長的影響。體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1，取處于生長對數(shù)期活性好的腫瘤細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液后細(xì)胞計數(shù)并均勻接種于96孔板中，細(xì)胞濃度為103個/孔。分別用不同濃度的瘦素、BDNF和（或）氟尿嘧啶（fluorouracil.5-FU）進(jìn)行干預(yù)處理，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，一定時間(24h、48h、72h)后，加入相應(yīng)MTT和DMSO液，酶標(biāo)儀57

7、0nm波長處測定其OD值。按照下列公式計算腫瘤增殖率和抑制率。腫瘤增殖率=（實驗組一對照組）/對照組×100％。腫瘤抑制率=（對照組一實驗組）/對照組×100％。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理所得數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ヌ±s)表示，定量資料的比較采用單因素多水平方差分析(one-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.結(jié)腸癌

8、細(xì)胞株DLD-1高表達(dá)瘦素和Trk B，不表達(dá)BDNF。正常腸上皮細(xì)胞株HIEC不表達(dá)瘦素和BDNF，低表達(dá)Trk B。
　　 2.瘦素的腫瘤增殖率隨濃度升高而逐漸增高，濃度小于10-9mol/L時與空白組比較增高不明顯(p＞0.05)，等于或大于10-9mol/L時與空白組比較顯著增高(p＜0.05)。同一濃度隨時間增加，腫瘤增殖率也逐漸上升。等于或大于10-9mol/L的各濃度，其24h與48h的增殖率相比較差異明顯(p＜0

9、.05)，但48h與72h無顯著差異(p＞0.05)。瘦素減少5-Fu的腫瘤抑制作用，24h、48h和72h均降低5-Fu的腫瘤抑制率，有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 3.BDNF的腫瘤增殖率隨濃度升高而逐漸增高。濃度等于或小于0.05μ g/mL時與空白組比較增高不明顯(p＞0.05)，大于0.05 u g/mL時與空白組比較顯著增高(p＜0.05)。同一濃度隨時間增加，腫瘤增殖率也逐漸上升。24h與48h差異不明顯(p

10、＞0.05)，72h腫瘤增殖率顯著高于24h(p＜0.05)。BDNF也能減少5-Fu的腫瘤抑制作用，24h、48h和72h均明顯降低5-Fu的腫瘤抑制率(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.瘦素能夠促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1增殖，濃度越高，時間越長，增殖作用越強(qiáng)。
　　 2.人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1高表達(dá)瘦素，說明在結(jié)直腸癌中，腫瘤細(xì)胞可以自己合成和分泌瘦素，促進(jìn)自身增殖。
　　 3.BDNF能