人白細(xì)胞介素-10真核表達(dá)載體pcDNA4-HisMaxA-hIL-10的構(gòu)建及其在兔滑膜細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、　　目的:本研究擬從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆全長人白細(xì)胞介素-10(hIL-10)基因，構(gòu)建hIL-10高效真核表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染兔滑膜細(xì)胞觀察其表達(dá)，探討IL-10基因治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的可行性?！　》椒?提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，并以寡聚核苷酸引物逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA。根據(jù)GeneBank中人IL-10mRNA全長開放讀框(NM000572)，設(shè)計(jì)合成人IL-10完整開放讀框序列的PCR引物，分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)

2、。RT-PCR擴(kuò)增目的基因hIL-10，回收純化PCR產(chǎn)物，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和T4連接酶作用下定向克隆入真核表達(dá)載體pcDNA4/HisMaxA，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA4/HisMaxA—hIL-10，酶切分析和DNA測序驗(yàn)證，確認(rèn)hIL-10全長開放讀框正確插入真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)。以復(fù)合陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)，重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染兔滑膜細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染后12h、24h、48h、72h和第7d、14d的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，應(yīng)用酶聯(lián)免