人白細胞介素４在衣藻葉綠體中的高效轉化及表達.pdf

1、葉綠體轉化是近些年發(fā)展起來的一項環(huán)境友好的基因工程技術，由于葉綠體基因組的高度多倍性，葉綠體轉化允許每個細胞中導入近百到數(shù)千個拷貝的外源基因，并表達較高水平的外源蛋白。近幾年來，盡管高等植物葉綠體表達系統(tǒng)也成功地高表達了數(shù)種蛋白質藥物，如人生長激素、人血清白蛋白、人胰島素、口服疫苗等，但由于植物葉綠體轉化及轉基因植物再生障礙、以及植物代謝產(chǎn)物復雜而不利于提取純化等問題，使得該項技術的應用受到限制。因此，人們把研究的目標轉向萊茵哈德衣藻的

2、葉綠體轉化系統(tǒng)。 本文利用PCR融合技術將人白細胞介素4基因(hIL4)融合到萊茵哈德衣藻葉綠體基因組rbcL 5’-UTR和3’-UTR非翻譯區(qū)序列之間，得到了5’UTR-hIL4-3’UTR融合表達單元；然后將其插入到來源于萊茵哈德衣藻葉綠體基因組5.7Kb的同源片段中，構建成pXhIL4同源重組交換質粒；利用電脈沖法將pXhIL4質粒與含有aadA基因的壯觀霉素抗性質粒p228共同轉化萊茵哈德衣藻葉綠體。 本實驗研

3、究了萊茵哈德衣藻的生長條件、生理特性以及在電脈沖轉化中所需的化學、物理參數(shù)及其與轉化效率的相關性，并進行轉化子篩選與檢測，初步探討了外源基因在萊茵哈德衣藻葉綠體中的同質化進程。從含有100ug/ml的壯觀霉素抗性平皿上篩選到陽性藻落，并通過PCR擴增方法檢測到hIL4基因，檢測結果顯示，其共轉化頻率高達90％。經(jīng)過Western blotting印跡轉移分析，證實了人白細胞介素4基因在轉基因萊茵哈德衣藻藻株中成功獲得表達。 本文