人白細(xì)胞介素-23受體（hIL-23R）基因的表達(dá)和初步研究.pdf

1、人白細(xì)胞介素-23受體(human Interleukin-23 receptor，hIL-23R))是2002年報(bào)道的細(xì)胞因子受體，和IL-12Rβ1共同組成IL-23受體復(fù)合物，IL-23R蛋白由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成，與IL-12Rβ2的胞外區(qū)域很相似，包含一個(gè)N端免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)細(xì)胞因子受體功能域。與IL-12Rβ2不同，IL-23R沒有鄰近膜的三個(gè)纖維蛋白原Ⅲ型功能域。在hIL-23R上有7個(gè)潛在的N-糖基化

2、位點(diǎn)，其胞膜近側(cè)區(qū)有類似于細(xì)胞因子受體特征性WSXWS模序的WQPWS，IL-23R復(fù)合物中的IL-12Rβ1能識(shí)別IL-23的IL-23p40亞單位并與之結(jié)合，由IL-23R介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 由于IL-23及其受體與IL-12及其受體在結(jié)構(gòu)上的相似性，所以人們對(duì)于IL-23及其受體的功能研究很多是基于對(duì)IL-12及其受體的研究進(jìn)行的。國外已有研究證明IL-23在抗腫瘤方面有一定的作用，而且IL-12Rβ2基因在慢性B細(xì)胞

3、惡性腫瘤中作為腫瘤抑制因子，但目前關(guān)于IL-23R和腫瘤的相關(guān)性尚未有報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)了在一些腫瘤細(xì)胞有IL-23R剪接異構(gòu)體的表達(dá)，但目前對(duì)于hIL-23R的功能研究尚處于初始階段，對(duì)于hIL-23R的功能研究很多正在進(jìn)行中。 本課題包括的研究內(nèi)容有：1)首先從外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中利用一對(duì)特異性引物克隆得到人白細(xì)胞介素23受體(hIL-23R)基因，分別構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-Myc-hIL-23R和原核表達(dá)

4、載體pGEX-4T-1-hIL-23R。2)真核表達(dá)hIL-23R蛋白，并研究其細(xì)胞定位及對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。3)原核誘導(dǎo)GST-hIL-23R融合蛋白表達(dá)。4)用基因工程方法分別構(gòu)建hIL-23R胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)帶有GST標(biāo)簽的hIL-23R蛋白分段表達(dá)，為進(jìn)一步研究hIL-23R的功能做準(zhǔn)備。 第一階段為克隆hIL-23R基因，從外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆得到1890bp的hIL-23R基因，連接于pM

5、D-19-T載體，用測(cè)序正確的pMD-19-T-hiL-23R做模板以PCR方法擴(kuò)增hIL-23R，分別構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-Myc-hIL-23R和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-hiL-23R。 在第二階段的工作中，通過將pCMV-Myc-hIL-23R轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，用RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)到其成功表達(dá)，用免疫熒光染色對(duì)hIL-23R蛋白在HEK 293T細(xì)胞和COS-7細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞

6、定位；并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了hIL-23R蛋白對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。 在第三階段的工作中，通過將pGEX-4T-1-hIL-23R轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，成功地誘導(dǎo)了帶有GST標(biāo)簽的hIL-23R重組蛋白。發(fā)現(xiàn)該蛋白以包涵體形式存在，并用Western-blot驗(yàn)證了GST融合蛋白的表達(dá)，為得到hIL-23R蛋白抗體做了準(zhǔn)備； 在第四階段的工作中，在大腸桿菌中成功地誘導(dǎo)了帶有GST標(biāo)簽的hIL-23R重組蛋

7、白的胞內(nèi)區(qū)和胞外區(qū)，改變誘導(dǎo)條件(低溫誘導(dǎo))后胞內(nèi)區(qū)蛋白有可溶性表達(dá)，而胞外區(qū)蛋白仍為包涵體表達(dá)，為hIL-23R蛋白的純化和制備針對(duì)hIL-23R胞內(nèi)區(qū)的抗體做準(zhǔn)備，利用其抗體可以研究hIL-23R與腫瘤的發(fā)生的相關(guān)性。 結(jié)論：我們從外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆得到了hIL-23R的編碼區(qū)，分別構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-hIL-23R和真核表達(dá)載體pCMV-Myc-hIL-23R。并分別在大腸桿菌和HEK 293T細(xì)胞中