丙酸睪丸素對(duì)小鼠精原細(xì)胞體外縱向分化的影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立體外培養(yǎng)體系，培養(yǎng)精原細(xì)胞，為精原干細(xì)胞研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；在雄激素的作用下，觀察精原細(xì)胞在體外分化過(guò)程中的變化，以了解精子發(fā)生中睪丸支持細(xì)胞以及雄性激素在精原細(xì)胞分化中所起的作用，為闡明精子發(fā)生所依賴的微環(huán)境提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：①飼養(yǎng)單層的制備：選取7-8天左右雄性小鼠，抽吸股骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bonemarrowstromalcells，BMSC)做原代培養(yǎng)3-4天，待基質(zhì)細(xì)胞伸出長(zhǎng)突起、相互交織形成單層細(xì)胞并鋪滿瓶

2、壁面積達(dá)70％時(shí)，用含10μg/ml絲裂霉素C的IMDM培養(yǎng)基處理1.5小時(shí)，充分清洗后作為飼養(yǎng)層備用；②睪丸支持細(xì)胞的分離純化：在無(wú)菌條件下剖腹取出7-8天左右雄性小鼠雙側(cè)睪丸，經(jīng)組合酶消化，在鏡下監(jiān)測(cè)，待生精小管基本解離成單個(gè)細(xì)胞團(tuán)時(shí)，用含血清的IMDM終止消化，離心棄去上清液，將細(xì)胞懸液平均接種在25ml的培養(yǎng)瓶中，瓶中預(yù)先放有0.1％多聚賴氨酸處理過(guò)的蓋玻片，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/ml，置37℃，5％CO2飽和濕度條件下培

3、養(yǎng)，4小時(shí)后換液加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),24小時(shí)后，每瓶加入1.5ml20mmolTris-HCL液低滲處理3分鐘，D-Hanks液清洗3次，加入培養(yǎng)基在同上條件下培養(yǎng)，待支持細(xì)胞融合成片時(shí)及時(shí)傳代，平均接種于六孔板中。③接種精原細(xì)胞：同法取7-8天左右雄性小鼠睪丸，按上述酶消化過(guò)程制備精原細(xì)胞懸液，并將懸液接種在制備好的BMSC飼養(yǎng)層上，置于34℃，5％CO2飽和濕度條件下共培養(yǎng)，72小時(shí)后，以特制的內(nèi)徑50-100μm的毛細(xì)玻璃彎管在倒

4、置相差顯微鏡下將精原細(xì)胞克隆球吸出，吹打均勻后加入胰酶，制成單細(xì)胞懸液，平均分配到六孔板中與睪丸支持細(xì)胞共同培養(yǎng)。④加入丙酸睪丸素：設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)組的共培養(yǎng)體系中加入不同劑量的丙酸睪丸素，濃度分別為0.1μmol/L；0.2μmol/L；0.5μmol/L；1.0μmol/L；1.5μmol/L，同時(shí)培養(yǎng)BMSC作為流式細(xì)胞儀二倍體內(nèi)部參照組。⑤檢測(cè)：在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并照相；對(duì)培養(yǎng)的精原細(xì)胞進(jìn)行堿性磷

5、酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)染色、c-kit受體檢測(cè)；對(duì)培養(yǎng)的支持細(xì)胞進(jìn)行H&E染色、油紅染色；對(duì)空白組和實(shí)驗(yàn)組，運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA倍性分析，了解各組的單倍體細(xì)胞率。 結(jié)果：①精原細(xì)胞在BMSC飼養(yǎng)層上克隆生長(zhǎng)，培養(yǎng)72小時(shí)，細(xì)胞增殖達(dá)到高峰，形成4-16個(gè)，甚至32個(gè)由細(xì)胞間橋相連成串的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞表達(dá)c-kit受體陽(yáng)性,ALP染色陽(yáng)性。②經(jīng)分離純化得到了高純度的睪丸支持細(xì)胞，鏡下觀察呈不規(guī)則的

6、多邊形，胞質(zhì)中見(jiàn)空泡，油紅染色呈橘黃色，提示為脂質(zhì)小體；③精原細(xì)胞與支持細(xì)胞共培養(yǎng)，在丙酸睪丸素的作用下，不同的濃度組均表現(xiàn)出向子代分化的趨勢(shì)，但各組的分化率不同，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，以0.5μmol/L組分化率最高，經(jīng)四格表χ2檢驗(yàn)差異具有顯著性(P＜0.01)。 結(jié)論：①精原細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞的共生性培養(yǎng)，可使這些細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中重新建立起聯(lián)系并進(jìn)行增殖，能成功地為精原細(xì)胞體外縱向誘導(dǎo)分化的研究提供細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。②雄性激素是?/p>