Trop2對小鼠骨密質(zhì)來源間充質(zhì)干細胞體外增殖、分化影響的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　干細胞參與胚胎發(fā)育的全過程,同時也存在于一些成體器官中,是由一群未分化的、持續(xù)自我更新的細胞組成。間充質(zhì)干細胞(MSC)最初分離自骨髓,是一群可以向骨、軟骨、脂肪及肌等分化的成體干細胞,這些細胞在多次分裂之后仍具備多向分化的能力。目前 MSCs已被許多的研究者,采用不同的方法從眾多的器官組織中分離獲得。由于這些成體干細胞至今仍沒有發(fā)現(xiàn)其特異的表面標志物,通常只能采用一系列細胞表面標志的組合來間接進行鑒定,為其

2、高效的體外分離與擴增帶來諸多不便。因此,找到真正能體現(xiàn) MSCs自我更新與分化功能的“干性標志”,并闡明其調(diào)控途徑將有利于對其自我更新與分化的分子機制的理解,有利于 MSCs基于細胞治療的臨床應用的發(fā)展。最近的研究提示,Trop2或許是一種新的干性標志。Trop2是隸屬于 TASTCAD基因家族的細胞表面糖蛋白,最初被發(fā)現(xiàn)表達于上皮細胞,通常也過表達于一些上皮來源的腫瘤組織,與腫瘤的發(fā)生及侵襲密切相關。最近有研究發(fā)現(xiàn) Trop2還表達于

3、“祖細胞樣的/干細胞樣的”人與小鼠的前列腺基底細胞和肝卵圓細胞上,并發(fā)現(xiàn)只有這些高表達 Trop2的細胞才表現(xiàn)出自我更新和向下分化的潛能。這一現(xiàn)象表明,或許Trop2參與維系這些“干細胞樣的”細胞的自我更新。盡管目前對 Trop2激活其下游信號通路的確切機制還沒有完全明確,但是其胞尾區(qū)的PIP2結合域提示, PI3K/AKT信號通路可能在其中起某種作用。本研究的目的是:明確是否小鼠基質(zhì)干細胞也可以合成 Trop2,并探討 Trop2對小

4、鼠骨密質(zhì)來源的MSC生物學作用的影響。
　　研究方法:
　　1.采用骨片法分離獲取小鼠MSCs,對其進行免疫表型鑒定和成脂及成骨誘導分化。
　　2.通過免疫熒光染色,利用激光共聚焦顯微鏡觀察 Trop2在小鼠MSCs細胞膜上的定位表達;通過 Western Blot檢測小鼠骨密質(zhì)來源 MSCs不同培養(yǎng)時期 Trop2的表達變化。
　　3.建立 Trop2基因敲除(Trop2 KO)小鼠模型,通過 RT-PCR、S

5、outhern Blot、Western Blot等方法分別從 DNA、RNA、蛋白表達水平進行鑒定。
　　4.利用流式細胞術檢測并比較 Trop2基因敲除小鼠來源 MSCs和野生型(WT)小鼠MSCs表型差異。
　　5.通過 CCK-8和CFSE檢測并比較 Trop2基因敲除小鼠來源 MSCs和WT小鼠MSCs細胞增殖能力的差異。
　　6.通過 RT-PCR和real-time PCR比較 Trop2基因敲除小鼠來源

6、 MSCs和WT小鼠MSCs在經(jīng)過完全成脂和成骨誘導之后,成脂標志基因 PPAR-γ2、Adipsin和成骨標志基因 Osteocalcin、Osteopontin的定量表達差異;通過特異性的油紅“O”和茜素紅染色來判別 Trop2基因敲除小鼠來源 MSCs和WT小鼠MSCs在經(jīng)過完全成脂和成骨誘導后脂滴聚集和礦物質(zhì)沉積的差異。
　　7.通過流式細胞術明確 Trop2基因敲除小鼠來源 MSCs和WT小鼠MSCs進入細胞周期S期細胞

7、百分數(shù)的差異;通過 Western Blot明確在傳代培養(yǎng)過程中Trop2基因敲除小鼠來源 MSCs和WT小鼠MSCs活化 AKT表達比率的差異,以及AKT通路下游Cyclin D1的表達差異;利用PI3K抑制劑 LY294002處理WT小鼠MSCs后明確活化AKT表達比率的差異以及其下游 Cyclin D1的表達差異,并將其與 Trop2基因敲除小鼠來源 MSCs進行比較,明確 Trop2對 AKT/Cyclin D1通路的影響。

8、r>　　研究結果:
　　1.骨片法可成功體外分離獲取小鼠MSCs,所獲取的MSCs不僅具備通過經(jīng)典方法獲取的MSCs的免疫表型特征,而且還可以向脂肪和骨誘導分化,是同質(zhì)性比較一致的間充質(zhì)干細胞。
　　2.通過激光共聚焦顯微鏡首次明確觀察到 MSCs細胞膜上 Trop2的定位表達,通過 Western Blot發(fā)現(xiàn) Trop2的表達量隨 MSCs體外分裂次數(shù)的增加而減少。
　　3.通過 RT-PCR、Southern B

9、lot、Western Blot明確鑒定了Trop2基因敲除小鼠的構建成功。
　　4.通過流式細胞術、RT-PCR、real-time PCR、Western Blot等檢測發(fā)現(xiàn),Trop2基因敲除小鼠和WT小鼠來源的MSCs在以下方面存在明顯差異:
　　(1)通過表型觀察發(fā)現(xiàn):與 WT MSCs相比,KO MSCs在第一代時同質(zhì)性較差,CD45陽性細胞(造血系細胞)混雜較多;隨著傳代至第4代后其同質(zhì)性漸趨一致。
　　

10、(2) CCK-8和CFSE檢測發(fā)現(xiàn):與 WT MSCs相比,KO MSCs的增殖速率明顯降低,細胞倍增時間明顯延長。
　　(3)成脂與成骨誘導實驗發(fā)現(xiàn):與 WT MSCs相比, KO MSCs在相同誘導之后脂滴聚集減少,礦物質(zhì)沉積減少; real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)完全誘導后 WT MSCs較來源于 KO MSCs的脂肪標志基因 Adipsin、 PPAR-γ2和骨標志基因 Osteocalcin、 Osteoponti

11、n分別高出400％、500％、350％和100％。
　　(4)細胞周期:與 WT MSCs相比,KO MSCs進入細胞周期 S期的細胞比率明顯降低。
　　(5) AKT/Cyclin D1:與 WT MSCs相比,KO MSCs活化 AKT的表達比率明顯降低,AKT信號通路下游細胞周期關鍵節(jié)點蛋白 Cyclin D1的表達明顯降低;但活化 AKT和Cyclin D1表達降低程度不及經(jīng) LY294002阻斷 AKT通路所引起的