雌激素在IBS模型大鼠慢性內(nèi)臟痛覺敏化中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、雌激素在大鼠慢性內(nèi)臟痛覺敏化中的作用及其機(jī)制研究 腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)作為臨床常見病與多發(fā)病，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，對(duì)中國(guó)及全球的經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生巨大影響。IBS的病因病理有待探討，全球目前尚無(wú)有效的治療方法。據(jù)報(bào)道，IBS女性患者約為男性患者的2～3倍，而且女性患者的癥狀隨月經(jīng)周期而波動(dòng)。因此，性別與痛的關(guān)系一直受到科學(xué)研究者的關(guān)注。 女性更易罹患各種疼痛疾病，以往認(rèn)為

2、，女性容易精神緊張、并易于就診等是主要原因。但近年的研究提示，男女之間多種精神心理評(píng)分和就診行為等并無(wú)差異，而女性的體表痛閾明顯低于男性。關(guān)于不同性別之間內(nèi)臟痛閾是否存在差異，罕見研究報(bào)道，結(jié)果也不一致。但多數(shù)學(xué)者認(rèn)同性激素是這種差異的成因之一。多見以動(dòng)物的動(dòng)情周期或人的月經(jīng)周期來(lái)研究體內(nèi)的性激素水平與軀體疼痛關(guān)系的報(bào)道。但亦有文獻(xiàn)報(bào)道月經(jīng)周期不影響熱刺激疼痛反應(yīng)，而血漿高雌激素水平卻與體表熱刺激疼痛有關(guān)。可見生理周期并不能完全反映動(dòng)物

3、體內(nèi)的性激素水平。因此，本研究在檢測(cè)動(dòng)物的動(dòng)情周期的同時(shí)還直接測(cè)量其體內(nèi)的雌激素水平。 痛覺產(chǎn)生有賴于外周與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相互作用，性激素可以在多水平上影響痛覺的產(chǎn)生和傳遞。眾多研究表明，NMDA受體的激活在痛覺過敏以及異常痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著重要的作用。有研究報(bào)道，在急性內(nèi)臟痛動(dòng)物模型上，雌激素受體和N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體的NMDAR1亞單位在脊髓背角上共表達(dá)

4、，這支持雌激素對(duì)NMDA受體有直接作用。鞘內(nèi)給予NMDA受體阻斷劑(D(-)-2-amino-5-phosphonopentanoicacid，AP-5)能抑制結(jié)直腸擴(kuò)張刺激引發(fā)的內(nèi)臟痛反應(yīng)，但在高雌激素組大鼠的抑制作用較低雌激素組大鼠的抑制作用弱。研究還發(fā)現(xiàn)，雌激素顯著增加了腰骶段脊髓中NMDAR1蛋白的表達(dá)。以上數(shù)據(jù)提示，在急性內(nèi)臟痛動(dòng)物模型中，雌激素是通過上調(diào)NMDA受體的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)脊髓的內(nèi)臟傷害性傳遞的。眾所周知，慢性內(nèi)臟痛比急

5、性內(nèi)臟痛的產(chǎn)生機(jī)制要復(fù)雜得多，存在慢性痛覺的敏化現(xiàn)象。可以肯定，急性造模的動(dòng)物不能很好地模擬IBS患者的慢性內(nèi)臟高敏狀態(tài)。2000年首次報(bào)道的A1-Chaer模型，采用新生期的結(jié)直腸擴(kuò)張刺激，導(dǎo)致成年大鼠出現(xiàn)長(zhǎng)期的內(nèi)臟高敏狀態(tài)，較好地模仿了IBS患者的特征，為研究IBS發(fā)病機(jī)制提供了可借鑒的動(dòng)物模型。該動(dòng)物模型的神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì)與受體功能狀態(tài)，與急性造模的大鼠之間有很大的不同。在慢性內(nèi)臟痛的動(dòng)物模型體內(nèi)的背根神經(jīng)節(jié)和脊髓內(nèi)臟相關(guān)神經(jīng)元中，N

6、MDA受體表達(dá)增強(qiáng)。在這種情況下，雌激素是否還能通過調(diào)節(jié)NMDA受體的表達(dá)與磷酸化來(lái)影響慢性內(nèi)臟痛呢？ 針對(duì)以上問題，本研究中檢測(cè)了雌性IBS模型大鼠的慢性內(nèi)臟痛與血清雌激素水平，并做了相關(guān)性分析，同時(shí)比較了高雌激素與低雌激素模型雌鼠的慢性內(nèi)臟痛反應(yīng)的程度。為了排除孕激素等其它性激素對(duì)雌激素作用的干擾，本研究中只檢測(cè)去卵巢和去卵巢加上雌激素替代的大鼠，以確定雌激素對(duì)慢性內(nèi)臟痛的作用及其潛在的機(jī)制。本研究比較了AP-5(NMDA受

7、體阻斷劑)在高、低雌激素IBS模型大鼠上對(duì)結(jié)直腸擴(kuò)張刺激的鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)對(duì)兩組大鼠的脊髓、背根神經(jīng)節(jié)上NMDA受體的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。本研究將為女性IBS的發(fā)病機(jī)制的探討，以及臨床上對(duì)女性IBS患者的診治提供理論依據(jù)。 1、慢性內(nèi)臟痛大鼠模型的特點(diǎn)及評(píng)價(jià) 1.1痛閾 大鼠成年后模型雌鼠的痛閾顯著低于對(duì)照雌鼠，模型雄鼠的痛閾亦顯著低于對(duì)照雄鼠。雌雄模型大鼠痛閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 1.2腹壁撤退反射評(píng)分

8、 在20-60 mmHg壓力的結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal distension，CRD)刺激下，模型雄鼠腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)評(píng)分明顯高于對(duì)照雄鼠，80 mmHg壓力下的CRD刺激，兩組雄鼠的AWR評(píng)分趨同，差異消失。在20 mmHg壓力的CRD刺激下，模型雌鼠的AWR評(píng)分高于對(duì)照雌鼠，40-80 mmHg壓力的CRD刺激，兩組雌鼠的AWR評(píng)分趨同，差異消失。 1.

9、3甩尾時(shí)間 以(50±1)℃恒溫水浴為熱致痛源，比較模型與對(duì)照大鼠的甩尾時(shí)間發(fā)現(xiàn)：模型大鼠的平均甩尾時(shí)間低于對(duì)照大鼠。 1.4結(jié)腸組織病理改變 比較對(duì)照和模型大鼠遠(yuǎn)端降結(jié)腸和直腸的局部組織學(xué)的病理改變。結(jié)果顯示，對(duì)照與模型大鼠經(jīng)過肉眼觀察和顯微鏡檢查，均未見明顯病理改變。 1.5模型雌鼠動(dòng)情周期與血清雌激素水平的關(guān)系 觀察19只模型雌鼠的陰道涂片，分別在其處于動(dòng)情前期(P)、動(dòng)情期(E)、動(dòng)情后期

10、(M)、間情期(D)時(shí)，采集大鼠血液測(cè)定雌激素水平。雌鼠在P期的雌激素水平明顯高于其它各期，此外，其它各期雌激素水平之間無(wú)顯著差異。 1.6動(dòng)物分組 模型組與對(duì)照組中又各自設(shè)立高雌激素組(E2組)與低雌激素組(OVx組)，兩組大鼠均去卵巢，E2組大鼠在測(cè)量?jī)?nèi)臟痛前兩天腹腔注射雌激素100μ g，OVx組大鼠則不補(bǔ)充雌激素。 2、慢性內(nèi)臟痛與血清雌激素水平的關(guān)系 2.1雌雄模型大鼠的放電比較 大鼠放

11、電反應(yīng)隨CRD壓力增加而增加，各壓力下放電的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在15 mmHg，30 mmHg，45 mmHg的CRD刺激下，模型雌鼠腹外斜肌放電反應(yīng)均高于模型雄鼠。 2.2模型雌鼠的腹外斜肌放電與血清雌激素水平關(guān)系 模型雌鼠的血清雌激素水平為115.70±26.34 pmol/L，最小值84.50pmol/L，最大值154.20 pmol/L。在20～80 mmHg壓力的CRD刺激下，模型雌鼠的腹外斜肌放電平均峰值與

12、血清雌激素水平正相關(guān)。 2.3高雌激素大鼠與去卵巢大鼠內(nèi)臟痛敏的比較 2.3.1大鼠的陰道涂片結(jié)果 高雌激素大鼠的陰道涂片見多邊形的角化細(xì)胞，體積大，呈動(dòng)情期表現(xiàn)，表明其體內(nèi)雌激素水平高。去卵巢大鼠的陰道涂片見圓形上皮細(xì)胞，體積小，呈間情期表現(xiàn)，表明其體內(nèi)雌激素水平低。 2.3.2腹外斜肌放電水平比較 在20mmHg的CRD壓力下，模型E2組大鼠的的腹外斜肌放電水平高于模型OVx組大鼠，兩組差別有

13、顯著性意義。另一方面，在20mmHg的CRD壓力下，對(duì)照E2組大鼠的的腹外斜肌放電水平與對(duì)照OVx組大鼠之間沒有明顯差別。說明雌激素可加重模型大鼠內(nèi)臟痛覺敏感性。 3、AP-5鞘內(nèi)給藥對(duì)慢性內(nèi)臟痛的抑制作用與血清雌激素水平的關(guān)系 3.1 AP-5椎管給藥的抑制作用 3.1.1 AP-5抑制作用的時(shí)效關(guān)系 AP-5的抑制作用在5min時(shí)最強(qiáng)，隨時(shí)間漸漸減弱。在模型OVx組與E2組，給藥5min、10min

14、、15min后的內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反應(yīng)程度均低于給藥前水平，差別有顯著性意義。說明AP-5對(duì)模型大鼠的內(nèi)臟痛有明顯的抑制作用。 3.1.2 AP-5對(duì)OVx組與E2組模型大鼠抑制作用的比較 OVx組與E2組在給藥5min、10min、15min、30min后，抑制百分比的差別無(wú)顯著性意義。 3.2 NMDAR1受體在OVx組與E2組模型大鼠的表達(dá) 3.2.1 E2大鼠與OVx大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)NMDAR1受體表達(dá)

15、 采用免疫組織化學(xué)方法，比較E2大鼠與OVx大鼠背根神經(jīng)節(jié)NMDAR1的表達(dá)。結(jié)果顯示，大鼠腰骶段脊髓背根神經(jīng)節(jié)陽(yáng)性細(xì)胞，多為圓形或橢圓形的神經(jīng)元，胞質(zhì)呈棕黃色，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示，與OVx大鼠相比，E2大鼠NMDAR1受體表達(dá)的平均光密度無(wú)明顯差別。 3.2.2 E2大鼠與OVx大鼠腰骶段脊髓NMDAR1受體表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)方法，比較E2大鼠與OVx大鼠脊髓背角神經(jīng)元NMDAR1的表達(dá)。結(jié)果顯

16、示，E2大鼠與OVx大鼠腰骶段脊髓均可見NMDAR1陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)呈棕黃色，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示，E2大鼠腰骶段NMDAR1受體表達(dá)的平均光密度與OVx大鼠無(wú)明顯差異。 3.2.3腸道中NMDAR1受體表達(dá) 在大鼠腸道內(nèi)在神經(jīng)叢中可見NMDAR1陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)呈棕黃色。綜上所述，本工作提示： 1.雌雄大鼠新生期接受結(jié)直腸擴(kuò)張刺激，成年時(shí)(8 wk后)都可引發(fā)慢性內(nèi)臟高敏，且其結(jié)直腸局部組織未見明顯的病理

17、改變，提示本模型可作為IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛的研究模型。 2.雌性模型大鼠內(nèi)臟疼痛的敏感性高于雄性模型大鼠，且與血清雌激素水平正相關(guān)，高雌激素模型大鼠的內(nèi)臟痛敏感性高于去卵巢模型大鼠，提示雌激素增加了直腸感覺的敏感性。 3.NMDA受體拮抗劑AP-5椎管給藥可減輕內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反應(yīng)，且減輕的程度在去卵巢大鼠與高雌激素大鼠并無(wú)差別，兩組大鼠的脊髓背角NMDAR1的表達(dá)差別無(wú)顯著性。提示雌激素可能沒有通過調(diào)節(jié)脊髓背角NMDAR1