雌激素在海人藻酸誘導(dǎo)去勢大鼠癲癇發(fā)作中的作用.pdf

1、癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見病。女性患者的癲癇發(fā)作與月經(jīng)周期密切相關(guān)，動(dòng)情前期的雌性大鼠癲癇發(fā)作閾值最低，這均提示癲癇發(fā)作與血清中雌激素水平升高和/或孕激素水平降低有關(guān)。 在臨床和動(dòng)物研究中，孕激素的抗癇作用已基本肯定，但雌激素在癲癇中的作用結(jié)果不一。本文前期的研究發(fā)現(xiàn)，大劑量雌激素具有促進(jìn)去勢大鼠癲癇發(fā)作的作用，但如何界定大劑量還是小劑量?大、小劑量雌激素對(duì)癲癇究竟有什么不同作用?國內(nèi)外文獻(xiàn)均無系統(tǒng)研究。因此，本研究在界定雌激素添加大、

2、小劑量的基礎(chǔ)上，對(duì)不同劑量雌激素預(yù)處理在癲癇發(fā)作中的作用進(jìn)行較為詳細(xì)的了解，包括選擇癲癇發(fā)作潛伏期和嚴(yán)重程度作為動(dòng)物行為學(xué)的評(píng)估；以海馬各區(qū)細(xì)胞計(jì)數(shù)作為海馬損傷程度的細(xì)胞學(xué)比較；選擇海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)變化、血清雌二醇水平和海馬雌激素β受體表達(dá)等作為衡量雌激素作用的生化指標(biāo)。 癲癇的病因和影響因素非常復(fù)雜，如果雌激素預(yù)處理對(duì)癲癇發(fā)作產(chǎn)生了影響，本文希望進(jìn)一步了解“雌激素對(duì)癲癇發(fā)作海馬的影響究竟涉及了哪些基因?表達(dá)改變的基因可能涉

3、及了哪些功能”? 本課題由三部分工作構(gòu)成，目的是探討雌激素對(duì)癲癇發(fā)作的影響。 第一部分雌激素預(yù)處理去勢大鼠癲癇發(fā)作模型制備及行為學(xué)觀察 目的：(1)了解雌性大鼠去勢(Ovx)后不同時(shí)間點(diǎn)及添加不同劑量雌激素后血清性激素的水平，篩選出具有代表性意義的大、小劑量雌激素作為致癇前動(dòng)物的預(yù)處理劑量；(2)評(píng)價(jià)雌激素預(yù)處理后選擇致癇時(shí)間點(diǎn)的合理性，明確雌激素預(yù)處理對(duì)致癇大鼠動(dòng)物行為學(xué)的影響。 方法：光鏡觀察雌性大鼠

4、陰道細(xì)胞涂片，了解其生理周期和去勢后的細(xì)胞學(xué)特征，用電化學(xué)發(fā)光法測定動(dòng)情前期、Ovx7d和Ovx13d以及用不同劑量苯甲酸雌二醇(EB：25ug/kg、1、2、4、8、和20mg/kg體重)處理5d后的去勢大鼠血清雌二醇(E2)、孕酮(P)和睪酮(T)的水平。在Ovx13d尾靜脈注射海人藻酸(KA：5mg/kg)致癇，按Racine分級(jí)，記錄癲癇發(fā)作潛伏期和嚴(yán)重程度。 結(jié)果：1)與正常雌性大鼠動(dòng)情前期相比，去勢大鼠陰道涂片顯示內(nèi)

5、皮細(xì)胞很少，并且血清E2、P、T水平均降低；2)比較Ovx7d和Ovx13d時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物血清E2水平，兩者無顯著差異，故選擇Ovx7d添加外源性EB是合理的；而Ovx13d的P水平降低和E/P比值升高，表明此時(shí)致癇容易成功；3)添加25ug/kgEB的動(dòng)物血清E2、P和T水平均低于動(dòng)情前期，但P水平高于Ovx動(dòng)物；血清E2水平隨著EB添加劑量增加而明顯增加，添加2mg/kgEB的動(dòng)物血清E2水平為可檢測的最高極限。EB25ug/kg和EB

6、2mg/kg組Ovx動(dòng)物血清E2水平呈顯著性差異，但P和T水平相仿，便于單獨(dú)比較E2的作用。4)25ug/kg和2mg/kg的EB預(yù)處理均能縮短去勢動(dòng)物癲癇輕度發(fā)作的潛伏期，僅2mg/kgEB預(yù)處理縮短了重度發(fā)作潛伏期。 結(jié)論：去勢大鼠陰道涂片細(xì)胞形態(tài)及性激素水平降低說明去勢是成功的；選擇25ug/kg和2mg/kg的EB分別作為小劑量、大劑量是有代表性意義的；在Ovx7d和Ovx13d時(shí)間點(diǎn)分別給予EB預(yù)處理和KA誘導(dǎo)癲癇發(fā)作

7、是有根據(jù)的；兩種預(yù)處理EB劑量均能縮短致癇大鼠“點(diǎn)燃”的潛伏期，大劑量EB預(yù)處理還能促進(jìn)癇樣放電的擴(kuò)散。 第二部分雌激素預(yù)處理對(duì)KA致癇去勢大鼠癲癇發(fā)作海馬的影響 一.雌激素預(yù)處理對(duì)KA致癇去勢大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響 目的：比較不同劑量雌激素預(yù)處理對(duì)致癇去勢大鼠海馬易損亞區(qū)神經(jīng)元缺失的影響，探討雌激素在癲癇發(fā)作中的作用。 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為9組，即Ovx、Ovx+EB25ug、Ovx+EB2mg、Ovx

8、+KA(輕度和重度)、Ovx+EB25ug+KA(輕度和重度)、Ovx+EB2mg+KA(輕度和重度)組。運(yùn)用免疫熒光組化技術(shù)，以NeuN陽性細(xì)胞顯示海馬存活的神經(jīng)元，應(yīng)用Image-ProPlus5.1軟件和SPSS11.5軟件分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和數(shù)據(jù)處理。 結(jié)果：1)EB預(yù)處理對(duì)非致癇鼠海馬易損亞區(qū)單位長度上NeuN陽性細(xì)胞數(shù)均無影響；2)無論是否用EB預(yù)處理，癲癇發(fā)作后海馬易損亞區(qū)均出現(xiàn)NeuN陽性細(xì)胞數(shù)減少；并隨癲癇發(fā)作程

9、度加重而加重；3)無論大劑量還是小劑量EB預(yù)處理，均能減輕致癇鼠海馬NeuN陽性細(xì)胞缺失。 結(jié)論：1)癲癇發(fā)作是導(dǎo)致海馬神經(jīng)元死亡的主要原因，神經(jīng)元缺失的程度隨癲癇發(fā)作程度加重而加重。2)不論小劑量還是大劑量雌激素，雖不能完全消除癲癇發(fā)作造成的損傷，卻具有減輕海馬易損亞區(qū)神經(jīng)元損傷的作用。 二.雌激素預(yù)處理對(duì)KA致癇去勢大鼠海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響 目的：分析不同劑量雌激素預(yù)處理的去勢大鼠以海人藻酸致癇前后

10、海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的水平變化，了解氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)變化、雌激素、癲癇發(fā)作之間的關(guān)系，探討雌激素在癲癇發(fā)作中的作用。 方法：去勢大鼠隨機(jī)分為9組，即Ovx、Ovx+EB25ug/kg、Ovx+EB2mg/kg、Ovx+KA(輕度和重度)、Ovx+EB25ug/kg+KA(輕度和重度)、Ovx+EB2mg/kg+KA(輕度和重度)組。用高效液相色譜(HPLC)測定各組實(shí)驗(yàn)大鼠海馬的興奮性氨基酸(Glu和Asp)及抑制性氨基酸(GA

11、BA和Gly)水平。 結(jié)果：1)小劑量和大劑量EB預(yù)處理的去勢非致癇大鼠海馬組織Glu和Asp水平均顯著下降，對(duì)抑制性氨基酸GABA和Gly幾乎不產(chǎn)生影響；2)去勢動(dòng)物無論是否給予EB預(yù)處理，癲癇發(fā)作均誘導(dǎo)了海馬抑制性氨基酸的顯著增加，而興奮性氨基酸改變不明顯；3)EB預(yù)處理對(duì)未致癇和致癇動(dòng)物的海馬組織氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)均產(chǎn)生了影響，對(duì)未致癇動(dòng)物的影響是降低興奮性氨基酸，對(duì)致癇動(dòng)物的影響是在誘導(dǎo)興奮性氨基酸的合成的同時(shí)，更誘導(dǎo)了抑

12、制性氨基酸的合成。 結(jié)論：癲癇發(fā)作是導(dǎo)致早期去勢大鼠海馬GABA和Gly水平升高的主要原因，EB預(yù)處理對(duì)未致癇和致癇動(dòng)物海馬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)有不同的影響，小劑量EB對(duì)癲癇造成的海馬損傷可能具有保護(hù)作用。 三.雌激素預(yù)處理對(duì)去勢大鼠致癇前后血清雌二醇水平和海馬組織雌激素β受體表達(dá)的影響 目的：分析不同劑量雌激素預(yù)處理的去勢大鼠致癇前后血清E2和海馬組織雌激素β受體(Erβ)的水平，探討E2、Erβ與癲癇發(fā)作的相關(guān)性

13、。 方法：將去勢大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Ovx組)、不同劑量EB干預(yù)組(Ovx+EB)、致癇組(Ovx+KA)和不同劑量EB預(yù)處理致癇組(Ovx+EB+KA)。分別利用電化學(xué)發(fā)光法與免疫印跡法檢測血清雌二醇(E2)濃度與海馬組織雌激素β受體(Erβ)表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：1)除小劑量EB(25ug/kg)預(yù)處理的去勢大鼠血清E2水平(88.8±3.23pmol/L)與Ovx組(88.49±8.31pmol/L)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

14、外，其余劑量EB預(yù)處理((≥)EB1mg/kg)的各組去勢大鼠血清E2濃度均明顯高于Ovx組，且E2水平隨EB的增加而增高，但不影響去勢大鼠海馬組織Erβ的表達(dá)。2)癲癇發(fā)作早期不僅降低了癲癇動(dòng)物血清E2的水平，也降低了海馬組織Erβ的表達(dá)，后者與癲癇發(fā)作的程度無關(guān)。3)小劑量EB預(yù)處理的致癇鼠海馬組織Erβ的水平與致癇前并無明顯差異(p＞0.05)，顯示其能有效抑制癲癇發(fā)作造成海馬Erβ的減少。 結(jié)論：去勢大鼠海馬Erβ的表達(dá)

15、水平主要與癲癇發(fā)作有關(guān)，小劑量雌激素能有效抑制癲癇發(fā)作造成海馬組織Erβ的減少。 第三部分雌激素預(yù)處理對(duì)KA致癇去勢大鼠海馬基因表達(dá)譜的影響 目的：分析雌激素預(yù)處理的去勢大鼠經(jīng)海人藻酸誘導(dǎo)癲癇發(fā)作后海馬基因表達(dá)譜，探討雌激素對(duì)癲癇發(fā)作大鼠海馬的影響。 方法：應(yīng)用含有10，000個(gè)基因的cDNA芯片，分析EB干預(yù)與否的KA誘導(dǎo)去勢大鼠海馬組織基因表達(dá)圖譜。應(yīng)用功能富集分析，篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因功能群。結(jié)果：EB逆

16、轉(zhuǎn)了去勢大鼠KA致癇后有顯著差異表達(dá)的基因共392個(gè)，其中有151個(gè)基因功能明確。EB組與KA組相比，功能明確的基因下調(diào)的有130個(gè)，上調(diào)的有21個(gè)。經(jīng)功能富集分析，共篩選出8個(gè)主要功能群，其中下調(diào)的功能群5個(gè)(21個(gè)基因)，主要涉及凋亡、抗凋亡與神經(jīng)發(fā)生、長時(shí)程突觸傳遞增強(qiáng)效應(yīng)等，上調(diào)的有3個(gè)(4個(gè)基因)，涉及細(xì)胞膜受體相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。 結(jié)論：EB能逆轉(zhuǎn)去勢大鼠KA誘導(dǎo)的癇性發(fā)作后海馬神經(jīng)元的基因表達(dá)，可能以促進(jìn)神經(jīng)元凋亡為