應(yīng)用胰島新生相關(guān)蛋白（INGAP）體外誘導胰島新生.pdf

1、第一部分大鼠胰腺導管干細胞的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 目的:建立成年大鼠胰腺導管干細胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定的方法。 方法: V型膠原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺組織，并經(jīng)過Ficoll密度梯度離心去除胰島組織，然后培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，而后加入EGF(表皮生長因子)和bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)繼續(xù)培養(yǎng)，7天可形成單層細胞，用0.25％胰酶-EDTA消化并傳代培養(yǎng)。取第2代細胞利用免疫熒光染色

2、和RT-PCR方法檢測CKl9、Pdx-1、Nestin、insulin及glucagon的表達。 結(jié)果:經(jīng)膠原酶灌注消化胰腺導管上皮，再經(jīng)過Ficoll密度梯度離心去除胰島組織，可使胰腺導管細胞得到較好的純化。免疫熒光結(jié)果示胰腺導管細胞CKl9、Pdx-1和Nestin染色呈陽性，陽性細胞率分別為(88.6±6.2)％，(84.6±8.6)％，(79.3±10.5)％，而insulin及glucagon染色為陰性。RT-PCR

3、結(jié)果顯示該細胞表達CK19、Pdx-1和Nestin基因。 結(jié)論:該方法可較好的分離出胰腺導管細胞，經(jīng)鑒定該法培養(yǎng)所獲細胞具有胰腺干細胞的特性。 第二部分應(yīng)用INGAP體外誘導胰腺導管干細胞向胰島D細胞分化 目的:建立體外誘導胰腺干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，應(yīng)用胰島新生相關(guān)蛋白(INGAP)建立新的誘導分化體系，實現(xiàn)體外胰島新生。 方法:體外分離培養(yǎng)SD大鼠胰腺導管干細胞，選取第2～6代干細胞進行分

4、步誘導分化，并于分化后期進行分組培養(yǎng)，INGAP組加入INGAP多肽，而對照多肽組加入對照多肽，誘導結(jié)束后收獲兩組新生類胰島樣細胞團(ILCs)分別行免疫熒光染色和RT-PCR檢測insulin和glugagon的表達，并通過葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗(GSIS)評價新生ILCs的胰島素分泌能力。 結(jié)果:第2～6代胰腺導管干細胞經(jīng)過體外四步誘導分化，INGAP組和對照多肽組均可形成ILCs，免疫熒光染色結(jié)果顯示ILCs insu

5、lin和glucagon染色均為陽性，RT-PCR檢測結(jié)果也證明INGAP組和對照多肽組ILCs均有insulin和glucagon基因的表達，其中insulin基因的相對表達量INGAP組為0.324±0.09，對照多肽組為0.102±0.04，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；glucagon基因的相對表達量INGAP組為0.260±0.05，對照多肽組為0.085±0.04，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而IN

6、GAP組insulin和glucagon相對表達量與正常胰島比差異均無統(tǒng)計學意義。新生ILCs在低糖和高糖刺激下的刺激指數(shù)INGAP組為(3.3±0.1)，對照多肽組為(2.6±0.4)，正常胰島為(3.1±0.4)；低糖和高糖刺激下胰島素分泌量INGAP組與對照多肽組相比有明顯增多(P<0.01)。 結(jié)論:通過建立的新的包含INGAP多肽的誘導分化體系可以獲得具有胰島素分泌功能的新生類胰島樣細胞團，為胰島移植來源提供了新的更有