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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
胰島主要由分泌胰高血糖素的α細(xì)胞,分泌胰島素的β細(xì)胞,分泌生長(zhǎng)抑素的δ細(xì)胞,分泌饑餓激素的ε細(xì)胞以及分泌胰多肽的PP細(xì)胞構(gòu)成。其中胰島β細(xì)胞作為體內(nèi)分泌胰島素的唯一細(xì)胞類(lèi)型,在血糖調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用,β細(xì)胞的功能異常通常會(huì)導(dǎo)致糖尿病等代謝性疾病,因此β細(xì)胞一直是研究的熱點(diǎn)。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn),在胰島中不同的細(xì)胞類(lèi)型之間存在相互的調(diào)節(jié)作用。胰島δ細(xì)胞通過(guò)旁分泌生長(zhǎng)抑素的方式對(duì)胰島α細(xì)胞和β細(xì)胞的活性進(jìn)行調(diào)
2、控。由藥物或遺傳因素導(dǎo)致的δ細(xì)胞中生長(zhǎng)抑素的異常分泌,可導(dǎo)致β細(xì)胞的內(nèi)分泌功能失調(diào),并進(jìn)而引發(fā)糖代謝紊亂和相關(guān)代謝性疾病。
盡管胰島δ細(xì)胞的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,但對(duì)于其功能尤其是在血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的作用,目前仍存在較大爭(zhēng)議。已有研究表明,盡管生長(zhǎng)抑素基因敲除小鼠的進(jìn)食后胰島素和胰高血糖素分泌水平均有顯著增高,但這些小鼠依然具有和正常小鼠相似的體重、胰島形態(tài)、胰島素和胰高血糖素含量、靜息血糖水平和胰島素敏感度。因此,這些研究
3、結(jié)果提示胰島δ細(xì)胞可能并不參與靜息狀態(tài)下血糖調(diào)控。為了對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行深入研究并進(jìn)一步解析δ細(xì)胞在胰島環(huán)路以及血糖穩(wěn)態(tài)中的作用,本實(shí)驗(yàn)利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng),構(gòu)建了可在分泌生長(zhǎng)抑素的細(xì)胞中特異性表達(dá)白喉毒素A片段的小鼠。由于白喉毒素A片段能夠抑制蛋白質(zhì)的合成進(jìn)而殺死細(xì)胞,因此小鼠體內(nèi)δ細(xì)胞可被特異性敲除。對(duì)該δ細(xì)胞特異性敲除小鼠的生理表型進(jìn)行了研究,并采用連續(xù)切片技術(shù)和免疫熒光的方法,通過(guò)胰腺組織的免疫熒光共染,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)?/p>
4、反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步研究了δ細(xì)胞在血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中的作用。
方法:
本實(shí)驗(yàn)選用的實(shí)驗(yàn)鼠為C57BL/6J小鼠,分別為胚胎期12.5天(E12.5)、15.5天(E15.5)和18.5天(E18.5)的胚胎鼠,新生1天的小鼠(P1)
5、,以及出生后1周(1week)和8周(8week)小鼠,以及SSTCre(+/+)和R26DTA(+/-)兩種工具鼠,兩者雜交獲得SSTCre(+/-)和S STCre(+/-);R26DTA(+/-)兩種實(shí)驗(yàn)鼠。另外還選用wistar大鼠乳鼠。取各時(shí)間點(diǎn)小鼠的胰腺,運(yùn)用連續(xù)切片技術(shù)和免疫熒光的方法,通過(guò)胰腺組織的免疫熒光共染,包括生長(zhǎng)抑素和胰島素的共染以及生長(zhǎng)抑素與胰高血糖素的共染,直觀(guān)顯示胰島δ細(xì)胞在小鼠不同發(fā)育階段的形成及分布情況
6、。通過(guò)免疫熒光和激光共聚焦顯微技術(shù)以及Q-PCR的方法驗(yàn)證SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)鼠胰島δ細(xì)胞的特異性敲除情況。通過(guò)生長(zhǎng)抑素和胰島素的共染以及生長(zhǎng)抑素與胰高血糖素的共染,直觀(guān)顯示δ,α和β細(xì)胞在SSTCre(+/-)和SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)這兩種小鼠以及各時(shí)間點(diǎn)小鼠中的數(shù)目和分布情況。通過(guò)Q-PCR的方法檢測(cè)小鼠中胰高血糖素,胰島素,胰多肽和饑餓激素的mRNA水平。采用ELISA實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)
7、小鼠血漿和胰腺中胰島素和胰高血糖素的含量。
結(jié)果:
通過(guò)系統(tǒng)研究胰島δ細(xì)胞的發(fā)育發(fā)現(xiàn),E15.5時(shí)δ細(xì)胞開(kāi)始分化出現(xiàn);E18.5天和P1的小鼠胰島初步形成,但尚不規(guī)則;1周小鼠胰島基本規(guī)則成型;4周和8周小鼠胰島形狀穩(wěn)定規(guī)則;δ細(xì)胞分布于胰島的外周。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Q-PCR確證了SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠胰島內(nèi)的δ細(xì)胞敲除情況。δ細(xì)胞特異性敲除小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的低血糖癥狀,其體重與血糖水平均
8、明顯低于SSTCre(+/-)對(duì)照組小鼠,并于出生后24小時(shí)內(nèi)死亡,通過(guò)給其皮下注射葡萄糖可以在一定范圍內(nèi)延長(zhǎng)SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠的平均壽命。ELISA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠血漿中的胰島素水平明顯高于SSTCre(+/-)小鼠,并且SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠胰腺內(nèi)的胰島素和胰高血糖素含量均高于SSTCre(+/-)小鼠。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明
9、,雖然SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠的胰島細(xì)胞總數(shù)目相較于S STCre(+/-)小鼠并無(wú)明顯差別,但是δ細(xì)胞的特異性敲除導(dǎo)致小鼠胰島內(nèi)α細(xì)胞和β細(xì)胞的比例明顯上升。
結(jié)論:
本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果直觀(guān)的顯示了小鼠胰島δ細(xì)胞的產(chǎn)生和分布情況,胰島δ細(xì)胞的發(fā)生及其與胰島內(nèi)其他內(nèi)分泌細(xì)胞之間的相互作用與胰島發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)。胰島δ細(xì)胞可能通過(guò)旁分泌的方式對(duì)胰島的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),胰島δ
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