miR-122對(duì)HBV調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、最近幾年，miRNA已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，它的發(fā)現(xiàn)不僅為生物學(xué)開辟了新的領(lǐng)域，更為其生物學(xué)原理應(yīng)用于疾病治療的轉(zhuǎn)譯研究提供了新的武器，曾一度被認(rèn)為是“垃圾”RNA的小分子近十年先后7次被美國(guó)《SCIENCE》評(píng)選為“年度全球十大科技突破”。到目前為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三千余種miRNAs，被認(rèn)為是最大的一類基因表達(dá)調(diào)控因子，它通過與靶基因的結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、增殖、分化和多種生物學(xué)信號(hào)通路，也可以起到腫瘤抑制基因和癌基因的作用，以及

2、應(yīng)用在疾病診斷和基因功能研究中。 多項(xiàng)研究結(jié)果表明miR-122是肝臟特異的miRNA，調(diào)節(jié)脂肪酸、膽固醇的代謝和肝臟的分化，上調(diào)嗜肝病毒HCV的復(fù)制。為了研究miR-122與HBV的復(fù)制關(guān)系，我們利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)在HBV上1689nt-1711nt區(qū)域存在miR-122的可能靶序列。首先利用miRNA的生物學(xué)原理，將miR-122的編碼基因hcr構(gòu)建在包含綠色熒光蛋白的載體上，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，hcr基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

3、，繼而在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)展為成熟的miR-122，實(shí)驗(yàn)中利用RT-PCR、T-A克隆技術(shù)對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的miR-122的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)獲得能穩(wěn)定表達(dá)miR-122的真核表達(dá)細(xì)胞系。為了驗(yàn)證miR-122作用HBV的靶點(diǎn)，首先，從HepG2215基因組DNA擴(kuò)增miR-15靶序列-BCL2，插入熒光素酶報(bào)告基因（luciferase）下游的Xba1酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了陽(yáng)性的miR-15熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，用于驗(yàn)證miR-122靶點(diǎn)的陽(yáng)性對(duì)照系統(tǒng)

4、。已有研究證明HBV在1689nt-1711nt位置有四種轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)miRNA的生物學(xué)原理推測(cè)miR-122可能對(duì)這四種mRNA都有作用，本實(shí)驗(yàn)選用其中之一的HBx來驗(yàn)證1689nt-1711nt序列與miR-122之間是否為靶向的關(guān)系。本研究構(gòu)建了包含HBx序列的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)及HBx蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，與miR-122共轉(zhuǎn)染到自身低表達(dá)miR-122的細(xì)胞系中，在過表達(dá)mirR-122、鎖定miR-122和突變miR-122三個(gè)