去細胞化技術建立全肝臟生物支架的實驗研究.pdf

1、肝臟是人體最大、最重要的腺器官，幾乎參與體內的一切新陳代謝活動，是物質代謝的中樞；肝臟也是人體重要的屏障器官，其解毒和吞噬功能與免疫密切相關。 近二十年來，肝病對人類的危害日益增加。我國是世界上病毒性肝炎和肝癌的高發(fā)國家。我國乙型肝炎表面抗原攜帶者約占整個人口的10%，全球每年死于肝癌的病人百余萬，我國約占總數(shù)的一半。各種原因引起的急性肝功衰竭，其死亡率達60～80%。而到目前為止，對于終末期肝病根本的治療方法只有器官移植，其它

2、的方法如透析、人工肝支持系統(tǒng)等雖然能延長病人的生命，但是不能替代肝臟的所有功能，很難防止病情惡化。目前，由于供體的短缺，許多需要器官移植的病人仍然只能在等待移植的名單上。并且肝臟移植需要數(shù)年的抗免疫治療，會導致對肝臟和腎臟的長期損害，擴展的醫(yī)療護理和住院時間也增加了治療的費用。肝組織工程，作為緩解供體短缺的一個步驟，具有重要的現(xiàn)實意義。 組織工程面臨許多共同的問題如支架的選擇、種子細胞的選擇、免疫排斥等。其中支架材料是組織工程研

3、究的重點之一，支架材料應有足夠的表面積用于細胞粘附，也應有足夠的空間使細胞集落擴展，增殖，足夠的孔隙以利于物質與氣體的交換，具有可降解性，良好的生物相容性。肝臟組織工程的以往的研究很多集中于微載體粘附培養(yǎng)、球形體聚集培養(yǎng)、微囊培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、可降解生物支架培養(yǎng)等。但是研究證明將貼附有肝細胞的微載體植入體內后肝細胞的代謝活性迅速降低。研究者認為主要是由于肝細胞具有復雜的代謝合成功能，使通過單純擴散方式供給營養(yǎng)物質與氧氣的普通培養(yǎng)方法很

4、難為肝細胞及時有效的提供營養(yǎng)及氧氣供應，目前解決該問題的研究主要集中在兩個方向：一、構建具有管道結構的模擬肝臟三維結構的支架；二、采用灌注培養(yǎng)的模式。常見的肝臟血管的模擬方法包括1、利用制造技術進行三維打印肝管道樣結構的生物支架；2、在支架材料上結合可以誘導血管形成的血管生長因子誘導毛細血管的形成，并可以對血管的密度進行控制，附合膠原有利于細胞的粘附。國外采用RFB反應器進行循環(huán)灌注式培養(yǎng)模式進行肝細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)出肝組織樣結構，肝臟功能

5、也可以維持較長時間。但總的來說在支架模擬肝臟的內在結構以提供充足氧氣與營養(yǎng)物質的供養(yǎng)從而維持肝細胞的功能方面仍然不能達到臨床上功能替代的要求。 去細胞化技術是組織工程支架材料研究的一門新技術，該技術將細胞破壞為碎片并將該碎片白細胞外基質上移除，而細胞外基質成分被保留。去細胞化的目標是移除所有的細胞及細胞核，同時將對保留細胞外基質的組成成分的生化結構、生物學活性及機械完整性的影響降低到最低限度。常用獲得去細胞的方法主要包括物理、化

6、學、酶學的方法。物理方法主要包括快速凍融、攪拌、超聲波；化學方法主要為運用酸性、堿性溶液、去污劑（曲拉通X-100，十二烷基磺酸鈉，熊去氧膽酸）等化學溶劑及利用高滲與低滲溶液；酶學的方法常利用胰蛋白酶與核酸內切酶、核酸外切酶。為了達到完全去細胞化的技術，常根據(jù)不同器官聯(lián)合應用不同的方法。細胞外基質由于其在細胞的生長、繁殖、遷移、分化、發(fā)育等生物學行為方面起到重要作用而受到生物學家的重視，同時由于細胞外基質成分在不同的物種之間具有高度保守

7、性，所以去細胞化技術得到的細胞外基質支架具有良好的生物相容性及低免疫原性。由于具有以上優(yōu)點，細胞外基質成分在組織工程的支架制備中成為常用的材料。去細胞化技術在心血管、輸尿管、膀胱等細胞外基質含量豐富的組織器官的組織工程的研究中已經得到應用，并在實驗與臨床研究中證明其具有良好的生物相容性，低免疫原性。但是該研究對于肝臟、腎臟等細胞含量豐富的器官的研究較少。 本實驗結合以前關于血管、心臟瓣膜、輸尿管、膀胱等組織器官去細胞化的方法，并

8、結合肝臟本身的特點，探索全肝臟去細胞化的方法，得到了保留肝臟基本管道與細胞外基質成分的肝臟生物支架。并進行生物支架的相容性研究，該支架在模擬肝臟的管道結構方面具有其獨特的優(yōu)勢，符合目前對肝臟支架的要求，可以作為肝臟組織工程的備選支架之一。 目的：研究利用去細胞技術獲取全肝生物支架的方法，并對得到的全肝生物支架保留的成分及結構進行組織學觀察，以及對其進行生物相容性驗證，為進一步的肝臟組織重建奠定實驗基礎。 方法：取SD大鼠

9、肝臟，將所得肝臟經門靜脈插管后依次灌注曲拉通X100（TritonX100），十二烷基磺酸鈉（SDS），用時約8小時，并用0.01mM的磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗支架上殘留SDS210h，將支架中殘留SDS的濃度降低至0.01%，將所得的標本放入-800C冰箱30分鐘快速冰凍，取出后在-20℃的條件下行病理切片，切片后行蘇木素-伊紅染色（H&E染色）。管道鑄型：將肝上下腔靜脈、及肝下下腔靜脈以1#絲線結扎，并以19G套管針行膽道插管，插

10、管后分別注入鑄型劑（鑄型劑的成分過氯乙烯塑料作為溶質、丙酮為溶劑配成8%～10%填充劑含油畫顏料，紅色為門靜脈，綠色為膽道）行膽道與門靜脈鑄型，觀察門靜脈與膽道結構的完整性；細胞外基質成分染色：將所得標本多部位隨機取材后多聚甲醛脫水，石蠟包埋后切片，行Masson's三色染色觀察有無膠原纖維保留，地衣紅染色觀察彈力纖維的保留情況，銀染觀察有無網(wǎng)狀纖維存在，電子顯微鏡觀察：將所得標本放入2.5%的戊二醛中固定，4°冰箱保存，送南方醫(yī)科大學

11、電子顯微鏡觀察室行觀察保留組織的超微結構及有無細胞殘存，生物相容性觀察：將標本行冰凍切片，切片厚度為50um，切片放入六孔培養(yǎng)板中，切片行Co60照射滅菌，所得切片與原代肝細胞、C3A細胞懸浮共培養(yǎng)，觀察該材料的生物相容性.原代肝細胞的獲取方法參照slegen的膠原酶兩步灌注法。 結果：經該方法灌注大鼠肝臟50個，成功35個，成功率70%，失敗的原因主要為灌注過程中出現(xiàn)管道扭轉、空氣阻塞、插管過深及凝血等原因導致肝臟灌注不夠完全

12、，主要表現(xiàn)為肝臟周邊有區(qū)域灌注不全、個別分葉無反應。利用去垢劑進行肝臟去細胞化的方法是有效的，但整個過程需注意保持血管通暢。1、灌注前后的肝臟相比，灌注后所得肝臟生物支架大體觀透明，包膜完整，保留了肝臟的形態(tài)，肉眼可見包膜內的Glisson系統(tǒng)保存。2、管道鑄型結果：管道鑄型結果可見膽道與門靜脈伴行保留，呈樹形結構，無鑄型液外溢，管道結構保持完整。3、組織學鑒定結果：各項組織染色結果未見明顯肝細胞殘留，未見到肝臟原有的小葉樣結構存在，但

13、是可以看到纖維圍成的管道樣結構，見大量膠原纖維染色、彈力纖維染色，未見明顯網(wǎng)狀纖維染色，掃描電子顯微鏡結果未見明顯細胞存在，可見大量纖維樣結構編織成網(wǎng)狀，并見管道樣結構，4、生物相容性鑒定結果：支架與細胞共培養(yǎng)結果示C3A細胞與切片后的肝臟支架共培養(yǎng)21天可以見到細胞粘附在懸浮于培養(yǎng)基中的切片支架上呈串珠樣生長，與普通平板相對比在形態(tài)無明顯差異，但生長時間明顯延長，證明該支架具有良好的生物相容性。 結論：經門靜脈插管灌注去垢劑是