犬去細(xì)胞喉支架的生物力學(xué)研究.pdf

1、全喉切除術(shù)使大量晚期喉癌病人的生命得以挽救，但同時也造成喉功能的永久喪失，嚴(yán)重影響了患者術(shù)后的生活質(zhì)量，目前仍然沒有理想的修復(fù)重建方法。為解決這一問題，人們嘗試進(jìn)行喉移植，這一方法卻帶來了新的問題：一方面同種異體的人類喉移植供體來源不足；另一方面嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)限制了喉移植的開展，終身應(yīng)用免疫抑制劑可部分降低免疫排斥對移植物的破壞作用，但易引起患者腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、感染和免疫力低下等問題。組織工程方法的不斷發(fā)展為很多組織和器官的修復(fù)重建提

2、供了可能。在皮膚、軟骨等較簡單組織的研究取得重大突破的啟示下，研究人員也嘗試?yán)媒M織工程方法再造全喉。由于全喉結(jié)構(gòu)精細(xì)復(fù)雜，目前研究工作多集中在部分喉缺損的重建方面，全喉作為整體進(jìn)行組織工程再造還需要在理論和技術(shù)上進(jìn)一步創(chuàng)新。近年來去細(xì)胞生物支架研究的不斷發(fā)展為這一難題的解決提供了新思路,去細(xì)胞技術(shù)在有效去除器官或組織內(nèi)細(xì)胞的同時保留了最接近機(jī)體的天然結(jié)構(gòu)和微環(huán)境。理想的組織工程支架材料除了具有一定的理化性能之外，還需要有一定的機(jī)械強(qiáng)度

3、維持形態(tài)。侯楠等利用動脈灌注的方法去除了兔喉黏膜和肌肉內(nèi)細(xì)胞，保留軟骨組織維持喉形態(tài)，得到完整的去細(xì)胞全喉支架。隨后取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成骨骼肌細(xì)胞后接種于喉支架的去細(xì)胞基質(zhì)中。在移植入體內(nèi)培養(yǎng)后有肌束樣組織出現(xiàn)，馬瑞娜等還對灌注得到的兔去細(xì)胞全喉支架進(jìn)行免疫學(xué)研究，結(jié)果顯示該支架生物相容性好，免疫原性低。但灌注方法對軟骨支架是否破壞了軟骨的生物力學(xué)性能，喉支架還能否滿足支撐作用仍不確定。
　　本研究旨在利用完整喉軟骨做支架

4、，通過雙側(cè)顱甲動脈順行持續(xù)注入去離子劑，有效去除喉部肌群和黏膜等免疫原性強(qiáng)的組織，制備出低免疫原性的犬去細(xì)胞喉支架，并明確該支架在灌注前后生物力學(xué)性能是否改變，進(jìn)一步評價同種異體生物人工喉支架的性能，為全喉重建提供新方法。
　　目的:
　　1.在兔喉灌注的基礎(chǔ)上，改良灌注方法制備去細(xì)胞犬喉支架。探討制備犬喉支架的可行性和尋找最佳灌注方法。
　　2.對正常未灌注喉的軟骨組織和灌注后的去細(xì)胞喉支架的軟骨組織進(jìn)行組織學(xué)和力學(xué)

5、性能的比較，明確灌注法制備的去細(xì)胞喉支架的生物力學(xué)性能是否發(fā)生了顯著改變，能否滿足支架再植入體內(nèi)的力學(xué)要求，為下一步喉缺損的修復(fù)提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.灌注法制備犬去細(xì)胞全喉支架
　　取離體犬全喉通過雙側(cè)顱甲動脈順行持續(xù)注入去離子劑，有效去除喉部肌群和黏膜等免疫原性強(qiáng)的組織，保留喉部肌肉的細(xì)胞外基質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和完整喉軟骨支架，制備出低免疫原性的犬去細(xì)胞喉支架，并對制備的去細(xì)胞全喉支架進(jìn)行大體、組織學(xué)和

6、掃描電鏡觀察。
　　2.犬去細(xì)胞全喉支架的生物力學(xué)研究
　　對灌注法制備的去細(xì)胞全喉支架和正常未灌注喉進(jìn)行Masson三色、阿爾新藍(lán)染色觀察，利用專業(yè)圖像分析軟件IPP(image-proplus)對切片行膠原和糖胺聚糖含量定量分析；掃描電鏡觀察和生物力學(xué)檢測。
　　結(jié)果:
　　1.灌注法制備犬去細(xì)胞全喉支架
　　大體觀察：對照組新鮮離體喉顏色鮮紅，結(jié)構(gòu)完整；灌注組離體喉經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）灌注三小時

7、后環(huán)甲肌可透明，20h后肌肉及粘膜完全透明,喉顏色蒼白，結(jié)構(gòu)完整未出現(xiàn)塌陷、變形，除顏色改變外形態(tài)與對照組喉相比無明顯變化。組織病理學(xué)觀察：HE染色示對照組喉肌纖維束完整，肌細(xì)胞存在，軟骨細(xì)胞充填于軟骨陷窩中；實(shí)驗(yàn)組喉肌細(xì)胞已去除，纖維結(jié)構(gòu)仍存在且保留了細(xì)胞外基質(zhì)的方向性，軟骨結(jié)構(gòu)完整，大量活性細(xì)胞充填于軟骨陷窩內(nèi)。掃描電鏡觀察：對照組肌肉結(jié)構(gòu)完整且無孔隙。灌注組肌肉細(xì)胞已完全去掉，纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)未破壞。
　　2.犬去細(xì)胞全喉支架的

8、生物力學(xué)研究
　　Masson三色、阿爾新藍(lán)染色：IPP軟件分析切片結(jié)果顯示對照組和灌注組無明顯差異（P值均>0.05）；掃描電鏡觀察軟骨基質(zhì)：灌注組軟骨基質(zhì)膠原纖維與對照組相比無明顯變化，未見明顯斷裂；生物力學(xué)檢測：壓凹試驗(yàn)和拉伸試驗(yàn)對照組和灌注組無統(tǒng)計學(xué)差異（甲狀軟骨壓凹試驗(yàn)，環(huán)狀軟骨壓凹試驗(yàn)，甲狀軟骨拉伸試驗(yàn)P值均>0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.通過改良灌注法可有效去除犬喉的肌肉和黏膜，保留喉部肌肉細(xì)胞外基質(zhì)