犬去細(xì)胞喉支架兩種體外保存方法的對(duì)照研究.pdf

1、頭頸部腫瘤中喉癌是最常見的癌癥，且發(fā)病率逐年遞增。喉癌目前主要治療方案仍為部分喉或全喉切除術(shù)[1]，術(shù)后長期聲音嘶啞或者不能發(fā)音，并嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)每年大約有25萬的喉癌患者行喉全切除術(shù)[2]。喉全切除術(shù)后選擇的一個(gè)積極治療方案為喉移植。但是，到目前為止，人類歷史上僅有2例成功的喉移植被報(bào)道[3,4]。臨床上近年來在組織結(jié)構(gòu)器官移植上進(jìn)步很大，并且在組織工程方面去細(xì)胞的支架已經(jīng)成功運(yùn)用。在去細(xì)胞喉支架的方面，我科已經(jīng)完成了兔

2、和犬喉支架的灌注，并對(duì)這種支架的組織相容性、免疫原性、生物力學(xué)進(jìn)行了檢測，為構(gòu)建去細(xì)胞同種異體喉軟骨支架提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)[5-9]。進(jìn)行喉移植前去細(xì)胞喉支架需進(jìn)行保存，以便為臨床受體的選擇創(chuàng)造時(shí)間。目前器官和軟骨保存臨床上常使用的方法有：冷凍保存、細(xì)胞培養(yǎng)液保存、器官保存液保存[10-14]。冷凍保存主要用于實(shí)質(zhì)器官的保存，缺點(diǎn)為保存時(shí)間短，如果保存軟骨，軟骨細(xì)胞易失活。細(xì)胞培養(yǎng)液是主要用在保存和培養(yǎng)細(xì)胞方面。器官保存液也主要用來保

3、存實(shí)質(zhì)器官，目前未見用于保存去細(xì)胞支架的報(bào)道。去細(xì)胞喉支架應(yīng)該如何保存？保存時(shí)間能否延長？保存后喉支架的結(jié)構(gòu)能否起到支撐作用？軟骨細(xì)胞能否存活？本實(shí)驗(yàn)比較了RPMI-1640培養(yǎng)基和HCA器官保存液兩種保存方法對(duì)犬去細(xì)胞喉支架的軟骨活性和軟骨性能的影響，探討去細(xì)胞喉支架保存的最佳方式和時(shí)間。
　　目的：
　　1.灌注法制備犬去細(xì)胞喉支架，探討灌注后犬去細(xì)胞喉支架的外形、組織學(xué)、軟骨細(xì)胞活性、生物力學(xué)的情況，并和兩種體外保存后

4、的支架進(jìn)行比較。
　　2.通過對(duì)犬去細(xì)胞喉支架兩種體外保存方法的對(duì)比研究，明確哪種方法更適合犬去細(xì)胞喉支架的保存，為下一步喉支架臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.制備犬去細(xì)胞喉支架及其形態(tài)學(xué)研究
　　通過環(huán)甲動(dòng)脈持續(xù)灌注 SDS、TritonX-100、PBS離子型去污劑，制備犬去細(xì)胞喉支架。在去除喉黏膜、肌肉、韌帶內(nèi)可溶性基質(zhì)的同時(shí)，保留細(xì)胞外基質(zhì)和低免疫原性的軟骨細(xì)胞及完整的去細(xì)胞犬喉支架。制備完后

5、，行大體觀察、組織學(xué)觀察及軟骨活性檢測。
　　2.犬去細(xì)胞喉支架體外保存的研究
　　實(shí)驗(yàn)組：將2組（各12只）犬去細(xì)胞喉支架分別放入RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)（A組）和HCA器官保存液內(nèi)（B組）進(jìn)行保存，1周、2周、4周、6周后取材。對(duì)照組（C組）：將另9只去細(xì)胞喉支架作為空白對(duì)照。3組均行大體觀察、組織學(xué)檢查、軟骨細(xì)胞活性檢測和生物力學(xué)性能檢測的對(duì)比。
　　結(jié)果：
　　1.制備犬去細(xì)胞喉支架及其形態(tài)學(xué)研究

6、>　　大體觀察：犬去細(xì)胞喉支架結(jié)構(gòu)完整、顏色蒼白，觸之有彈性，按壓無變形。HE染色示：喉支架肌群去細(xì)胞完全，軟骨細(xì)胞良好填充于軟骨陷窩內(nèi)。PDA-PI雙熒光染色示：去細(xì)胞喉支架冰凍切片示軟骨細(xì)胞發(fā)出黃綠色熒光，軟骨陷窩內(nèi)軟骨細(xì)胞存活良好，結(jié)構(gòu)完整。
　　2.犬去細(xì)胞喉支架的體外保存的研究
　　將實(shí)驗(yàn)組的2組犬去細(xì)胞喉支架保存4個(gè)時(shí)間段后取材進(jìn)行檢測。A組保存2周時(shí)和B組保存6周時(shí)去細(xì)胞喉支架外形變形明顯，軟骨細(xì)胞失活，壓凹硬

7、度試驗(yàn)硬度改變明顯。保存2周、4周A、B兩組組間甲狀軟骨厚度有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1=3.92，P1＜0.01；t2=4.54，P2＜0.01）。在保存2周、4周時(shí)A、B兩組組間甲狀軟骨壓縮模量比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1=3.36，P1＜0.01；t2=3.13，P2＜0.01）。B組保存4周時(shí)去細(xì)胞喉支架硬度、軟骨細(xì)胞活性和甲狀軟骨壓縮模量與對(duì)照組比較基本無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.通過環(huán)甲動(dòng)脈灌注能夠清除肌肉和黏膜的