肝臟脫細(xì)胞生物支架的制備及誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞肝向分化的研究.pdf

1、肝移植是目前針對終末期肝病的有效治療方式。然而,供肝短缺、手術(shù)并發(fā)癥、慢性排斥反應(yīng)和醫(yī)療成本高等限制因素迫使研究者開始尋求新的替代治療,并誕生了肝臟組織工程和再生醫(yī)學(xué)這一新興研究領(lǐng)域。在過去的數(shù)十年中,盡管研究人員在仿生三維動態(tài)培養(yǎng)方面取得了較大進(jìn)展,但仍難于完全模仿肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的復(fù)雜微環(huán)境。目前,全器官脫細(xì)胞支架正逐漸受到研究者的關(guān)注。脫細(xì)胞是指去除臟器中細(xì)胞成分,并且最大程度地保留臟器的大體形態(tài)、ECM成分和超微結(jié)構(gòu)。一

2、些研究成功地將功能性實質(zhì)細(xì)胞或特定干/祖細(xì)胞種植于脫細(xì)胞ECM,為組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究提供新的研究平臺。
　　脫細(xì)胞支架研究的一個難題是脫細(xì)胞方案的選擇和優(yōu)化。近年來,研究人員已通過比較研究對心臟、腎臟、肺和膀胱等器官的脫細(xì)胞方案進(jìn)行了改進(jìn)。目前,文獻(xiàn)中已報道了多種方案制備脫細(xì)胞肝支架(DLB),但尚無研究對上述方案制備DLB的理化性質(zhì)、細(xì)胞相容性和免疫原性進(jìn)行比較。該研究領(lǐng)域的另一難題是如何獲取足夠數(shù)量且功能完備的肝細(xì)胞。由于

3、自體肝組織獲取和體外維持肝細(xì)胞特性等方面存在困難,從干/祖細(xì)胞獲取肝細(xì)胞成為目前該領(lǐng)域關(guān)注的研究熱點。其中,間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)被認(rèn)為是最具治療潛力的細(xì)胞類型之一。目前已有多項研究證實了MSCs在特定培養(yǎng)條件下可誘導(dǎo)分化為類肝細(xì)胞。但誘導(dǎo)成功率較低,并且誘導(dǎo)的類肝細(xì)胞只具有成熟肝細(xì)胞的部分標(biāo)志物和功能。因此,對 MSCs肝向分化誘導(dǎo)方案和培養(yǎng)條件還需要進(jìn)一步研究。近期一些研究證實組織特異性 ECM可促進(jìn)干/祖細(xì)胞定向分化。本研究將探

4、討DLB是否能夠體外誘導(dǎo)MSCs向肝系細(xì)胞分化。
　　本研究利用三種文獻(xiàn)報道的洗脫方案(CHAPS、SDS和Triton X-100方案)和一種新建立的方案(NP-40方案)制備大鼠DLB,全面評估DLB的結(jié)構(gòu)特點和生化特性及其細(xì)胞相容性和免疫原性,為DLB制備方案的改進(jìn)提供依據(jù);本課題還利用大鼠DLB制成的三維支架,為小鼠MSCs提供體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化微環(huán)境,為體外高效誘導(dǎo)MSCs向肝系細(xì)胞分化尋找新的方法;最后,將體外預(yù)分化的

5、MSCs移植給CCl4致肝纖維化小鼠,進(jìn)一步觀察DLB體外誘導(dǎo)分化MSCs的在體功能,并對其治療作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　主要研究成果如下:
　　1.除CHAPS方案外,SDS、Triton X-100和NP-40方案均成功制備出符合脫細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的大鼠DLB,但不同方案制備的DLB在超微結(jié)構(gòu)、ECM成分、細(xì)胞相容性和免疫原性存在明顯差異;與SDS和Triton X-100方案相比,NP-40方案制備的DLB具有更好的細(xì)胞支持作用

6、和體內(nèi)重塑結(jié)局;另外,統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DLB體內(nèi)重塑結(jié)局與DNA殘留量、M2巨噬細(xì)胞數(shù)量和M2:M1細(xì)胞比值具有顯著相關(guān)性。
　　2.從GFP基因敲入C57BL/6小鼠體內(nèi)成功分離和培養(yǎng)出骨髓干細(xì)胞,表達(dá)MSCs的細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志物;NP-40制備的DLB為種植的MSCs提供了三維生長微環(huán)境;與DLB和培養(yǎng)瓶(TCF)靜止培養(yǎng)相比,動態(tài)培養(yǎng)的DLB顯著提高M(jìn)SCs的細(xì)胞存活率和增殖速度。
　　3.動態(tài)培養(yǎng)肝支架(DCS)本身

7、或聯(lián)合肝細(xì)胞誘導(dǎo)生長因子(GF),均能體外誘導(dǎo)MSCs向肝系細(xì)胞分化;與TCF培養(yǎng)相比,DCS培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)更高水平的肝細(xì)胞標(biāo)志物(AFP、ALB、CK7、CK8、CK9、CK19、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和肝細(xì)胞代謝酶等),并具有更強(qiáng)的肝細(xì)胞相關(guān)合成和代謝功能(分泌 AFP和ALB、代謝尿素、合成糖原、攝取吲哚氰綠和低密度脂蛋白),以及具有成熟肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點。
　　4.與未分化MSCs相比,體外利用GF預(yù)處理或DCS聯(lián)合GF預(yù)處理的M

8、SCs在移植給CCl4致肝纖維化小鼠后顯著改善小鼠生存率、肝臟功能和纖維化程度;其中DCS聯(lián)合GF預(yù)處理MSCs的歸巢效率最高。定植到肝臟的預(yù)分化MSCs主要通過旁分泌作用抑制肝星狀細(xì)胞活化、刺激內(nèi)源性肝細(xì)胞增殖,達(dá)到修復(fù)肝損傷的目的。
　　上述結(jié)果表明,本研究建立了一種新的肝臟脫細(xì)胞方案,制備的DLB具有良好的細(xì)胞相容性和較低的免疫原性;這種DLB在動態(tài)培養(yǎng)條件下可以高效地誘導(dǎo)MSCs向類肝細(xì)胞分化、表達(dá)更加穩(wěn)定和豐富的肝細(xì)胞功