在體去細(xì)胞腎臟生物支架制備的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　成功的器官移植術(shù)是目前治療后期器官功能衰竭的最行之有效的方法，但就當(dāng)今現(xiàn)狀而言，此術(shù)對(duì)供體的需求要遠(yuǎn)大于現(xiàn)有供體的數(shù)量，特別是在文化、習(xí)俗相對(duì)傳統(tǒng)的亞洲國家，由于器官捐獻(xiàn)制度和理念的差別，中國、韓國、泰國及其他東南亞國家的器官移植手術(shù)因?yàn)楣w數(shù)量的制約而受到很大的限制。很多的患者由于在最后的日子里，沒能等到合適的供體來進(jìn)行器官移植從而失去寶貴的生命。在如此殘酷的現(xiàn)實(shí)下，患者急需科研工作者發(fā)現(xiàn)新的組織工程學(xué)方法

2、或者依據(jù)再生醫(yī)學(xué)的策略支持研究生物人工器官來替代原有器官的功能，或者也可把細(xì)胞移植作為器官移植的補(bǔ)充選項(xiàng)，但大多數(shù)細(xì)胞的正常生長和增殖都離不開特定的、適宜的微環(huán)境和三維支持結(jié)構(gòu)。因而依靠組織工程學(xué)方法接近并達(dá)到這些條件是解決終末期器官功能衰竭的必然途徑。
　　組織工程學(xué)方法的最主要的意義是運(yùn)用各種條件、物質(zhì)，重建組織或者器官，并以此種組織或器官在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理和功能上替代已經(jīng)衰竭或受損嚴(yán)重的相應(yīng)器官，重新發(fā)揮正常人體的器官功能。

3、組織器官工程學(xué)的研究范圍一般涉及至少三個(gè)最為基本的部分:①具有組織特異性的細(xì)胞;②相應(yīng)器官的支架材料，又可細(xì)分為生物和非生物材料;③適合細(xì)胞生長成為目的性組織的微環(huán)境。隨著細(xì)胞來源、增殖、分化等方面地深入研究，各種不同組織特異性細(xì)胞都能在體外獲得并培養(yǎng)。而多種細(xì)胞在體外培養(yǎng)中通過去分化或者上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在幾天內(nèi)失去它們的形態(tài)和功能。這也側(cè)面證明了微環(huán)境對(duì)維持細(xì)胞功能起著非常重要的作用。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)不僅僅給組織特異性的細(xì)胞提供可依

4、附的支架，也可調(diào)節(jié)它們的黏附、浸潤、遷移能力，影響其生長、分化、增殖和存活，甚至可誘導(dǎo)、改變不同細(xì)胞間的相互作用。目前在血管、膀胱以及氣管等組織的工程化已經(jīng)取得非常成功的進(jìn)步。但是，對(duì)大器官如心臟、肺、腎臟以及肝臟等整個(gè)器官來說，器官重建必須要求在移植后血液能迅速支持，這就需要重建或保持廣泛的血管網(wǎng)絡(luò)來運(yùn)送營養(yǎng)物質(zhì)和進(jìn)行氣體交換，使移植后的組織工程化的器官能得到營養(yǎng)供應(yīng)和氧分支持。
　　然而，僅僅延續(xù)過往的浸泡法，將薄層的細(xì)胞組織

5、浸入到不同的液體中制備去細(xì)胞器官支架是不夠的。浸泡法是指通過酶或去污劑浸泡、滲透以溶解、洗脫細(xì)胞，主要利用的是組織間的滲透作用進(jìn)行去細(xì)胞化，對(duì)于結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單一點(diǎn)的組織如神經(jīng)，瓣膜，血管，肌腱，真皮，小腸粘膜下層等組織均可以達(dá)到理想的脫細(xì)胞效果。而對(duì)于三維結(jié)構(gòu)更加精細(xì)復(fù)雜的臟器，僅利用組織的滲透作用很難達(dá)到對(duì)器官每個(gè)局部均勻脫去細(xì)胞的作用。與浸泡法不同的是，灌注法常利用器官內(nèi)在的天然脈管系統(tǒng)為通路，使化學(xué)去污劑迅速到達(dá)器官的各個(gè)部位，在脫

6、去其細(xì)胞成分的同時(shí)，保留形態(tài)完好、結(jié)構(gòu)完整的均質(zhì)狀細(xì)胞外基質(zhì)。此外，在整個(gè)去細(xì)胞過程中及時(shí)引流出去多余、廢棄的灌注液，可減少對(duì)自身沒有脈管系統(tǒng)的部分組織去細(xì)胞化的作用的效果，避免化學(xué)去污劑破壞原有結(jié)構(gòu)?？偠灾嘧⒎ㄊ窃谧匀辉嫉拿}管基礎(chǔ)上，通過使用合適的化學(xué)去污劑將整個(gè)器官的所有細(xì)胞成分有效脫去，只留下蛋白成分豐富的細(xì)胞外基質(zhì)。我們可以明顯的發(fā)現(xiàn)其去細(xì)胞的效率與效果均高于以往的表面漂洗、浸泡等作用方法，并打破了以往只能制備輕、薄組織

7、和空腔臟器細(xì)胞外基質(zhì)的限制，將去細(xì)胞作用范圍擴(kuò)展至各個(gè)實(shí)質(zhì)性臟器，使越來越多的學(xué)者開始關(guān)注實(shí)質(zhì)性臟器去細(xì)胞生物支架制備的方法改良和再生研究。而將以往制備離體器官生物支架的觀念向在體制備轉(zhuǎn)移，也是一種突破。器官支架離體制備法脫離了機(jī)體獨(dú)特的生理環(huán)境，往往需要進(jìn)行懸掛、捆綁等操作，容易受重力、外力等因素的作用，進(jìn)而容易損傷到器官的形態(tài)特點(diǎn)、空間結(jié)構(gòu)和生物機(jī)械功能。相反，在體制備器官支架時(shí)，實(shí)驗(yàn)者都參考實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理血流灌注情況，選擇相似或相

8、近的灌注方向、流速，保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程符合器官的生理學(xué)特性。在今后的研究中，相信也會(huì)有更多的學(xué)者重視通過灌注法在體制備器官去細(xì)胞生物支架。當(dāng)然，在這一方法中也還存在許多的問題，比如，不同的臟器由于其結(jié)構(gòu)、功能的差異，該怎樣選擇合適的去污劑，怎樣選擇合適的流速，怎樣選擇合適的溫度等。
　　腎臟去細(xì)胞化的研究著眼于通過化學(xué)去污劑灌注器官而獲得組織特異性的細(xì)胞外基質(zhì)，使整體器官生物支架的制備成為可能。整體腎臟器官去細(xì)胞支架維持了整體的血管

9、網(wǎng)絡(luò)床，這些血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)不僅為目標(biāo)類型的細(xì)胞通過傳統(tǒng)路徑再植提供可能，也為再植的細(xì)胞提供了三維的生長環(huán)境，而薄層的去細(xì)胞化組織只能提供二維的生長空間。故而，本研究將著重探討完整實(shí)質(zhì)器官——腎臟生物支架材料的在體制備及相容性鑒定的研究。
　　方法：
　　1.制備去細(xì)胞全腎生物支架
　　從大鼠腎血管平面以下的腹主動(dòng)脈處插管作為灌注入口，分離并剪開腎血管平面以下的腔靜脈作為液體排出口，依次灌注0.05％肝素PBS溶液500m

10、l、1％TritonX-100溶液1000ml、1％SDS溶液1000ml后切取雙側(cè)腎臟。
　　2.病理學(xué)觀察
　　①肉眼觀察腎臟大體顏色、形態(tài)的改變。
　?、贖E染色、Masson三色、糖原(PAS)染色后，光鏡下觀察腎組織微結(jié)構(gòu)。透射電鏡(TEM)下觀察腎組織的超微結(jié)構(gòu)。
　　3.免疫熒光染色
　　組織石蠟包埋，切片厚約4 um-6 um。脫蠟水化處理后，加第一抗體(collagenIV抗體、LN抗體、

11、FN抗體、HSPG2抗體、Elastin抗體)孵育過夜，次日加第二抗體羊抗兔IgG（PE標(biāo)記）。隨后，DAPI染液復(fù)染后觀察。
　　4.腎組織DNA含量分析
　　提取等量腎組織所含的全部基因組DNA進(jìn)行定量分析，一份樣本通過紫外分光光度計(jì)測定吸光度，另外一份則做瓊脂糖凝膠電泳。
　　5.皮下植入實(shí)驗(yàn)
　　切開大鼠脊背中線兩側(cè)皮膚全層至肌層，完全分離皮下組織，制備近似支架大小的皮下囊，植入去細(xì)胞腎臟生物支架組織材料

12、，再定時(shí)觀察手術(shù)切口及支架埋藏部位的組織有無紅腫、感染的跡象。
　　結(jié)果：
　　1.大體觀察
　　在整個(gè)灌注過程中，腎內(nèi)細(xì)胞從邊緣向中心處逐漸脫去，細(xì)胞碎片也逐漸被沖洗干凈，最終可見被血液充盈的雙側(cè)紅褐色腎臟最終變成無色半透明狀，腎門處可見腎動(dòng)脈的重要分支。
　　2.病理學(xué)觀察
　　HE染色、Masson三色、糖原(PAS)染色及透射電鏡均顯示多個(gè)形態(tài)類似腎小球、腎小管輪廓的完整網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且纖維連續(xù)分布，基

13、膜連續(xù)完整。
　　3.免疫熒光染色觀察
　　免疫熒光技術(shù)結(jié)合DAPI染色后，表明去細(xì)胞過程中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的重要結(jié)構(gòu)蛋白collagen IV、層粘連蛋白(LN)、纖維連接蛋白(FN)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖2(HSPG2)、彈性蛋白(Elastin)都較好的得到了留存，而細(xì)胞膜逐漸破裂，細(xì)胞核在化學(xué)去污劑灌注的過程中逐漸減少，直致完全消失。
　　4.組織DNA含量分析
　　最終留存的去細(xì)胞腎臟生物支架中組

14、織的DNA含量為4.90 ng/mg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國際規(guī)定的去細(xì)胞支架的最低標(biāo)準(zhǔn)。
　　5.皮下植入實(shí)驗(yàn)
　　手術(shù)初期炎癥反應(yīng)較重，傷口紅腫。隨后，炎癥反應(yīng)逐漸減輕，支架內(nèi)逐漸有毛細(xì)血管發(fā)生、出芽、生長，基質(zhì)也逐漸降解、消失。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)通過大鼠在體依次灌注不同類型化學(xué)去污劑TritonX-100、SDS溶液法成功制備了雙側(cè)全腎去細(xì)胞生物支架(DKM)，并通過多個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)支架制備過程中的關(guān)鍵步驟、關(guān)鍵試