食管癌患者生存期與單核苷酸多態(tài)和免疫功能狀態(tài)關系.pdf

1、1研究背景和目的:
　　食管癌(Esophageal cancer, EC)是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一，預后極差，中晚期患者5年生存率僅15％左右。因早期EC無明顯特異性癥狀，臨床上95％以上EC患者首次確診時已是中晚期。令人驚奇的是，我們研究小組在EC高發(fā)區(qū)現場隨訪普查中發(fā)現，一部分中晚期EC患者可長期生存達10年(超長期生存，ultra-longer survival，ULS)。這種現象的機制尚不清楚。進一步分析發(fā)現無淋

2、巴結轉移和發(fā)病年齡早是食管癌患者超長期生存的重要影響因素。很顯然，闡明中晚期超長期生存食管癌患者的分子和免疫功能變化特征和規(guī)律對揭示這一獨特現象的分子機制和臨床應用均具有重要意義。
　　本研究組已完成2.5萬例EC和對照組全基因組關聯分析(GWAS)研究，發(fā)現2個EC易感基因（自然-遺傳，2010），證明了遺傳的分子基礎，但尚未闡明GWAS發(fā)現的單核苷酸多態(tài)(SNPs)與EC生存關系。近年腫瘤免疫研究提示機體免疫狀態(tài)與腫瘤發(fā)生、發(fā)

3、展密切相關。因此，本研究擬從SNP遺傳變異和免疫功能狀態(tài)角度探討EC患者超長期生存相關分子機制，即，(1)對比分析短期生存和ULS的EC患者臨床病理變化，揭示ULS患者臨床病理特征及相關影響因素;(2)在本實驗室前期已完成的1，077例EC病例和1，073例對照人群的GWAS初篩數據基礎上，選擇初篩發(fā)現的40個生存相關SNPs，在3，921例有生存隨訪的EC患者中進行基因分型驗證，并運用Cox多因素回歸模型分析不同基因型與患者生存時間關

4、系;(3)采用流式細胞分析(flow cytometer, FCM)和免疫組織化學(immunohistochemisty, IHC)技術對相關免疫分子在EC患者外周血及腫瘤組織中進行驗證，確定食管癌預后相關免疫分子。
　　2研究對象:
　　2.1超長期食管癌患者臨床病理特征及影響因素分析:從本室已建立的超長期和短期EC資料庫中，根據明確病理診斷、治療方式、生存期隨訪結果及問卷調查，最后選定30，718例EC患者進入分析。其

5、中ULS患者7，180例;短期生存患者23，538例。
　　2.2基于GWAS初篩數據的生存期相關SNPs分析:進入GWAS研究對象共6，047例。其中初篩2810例（病例組1077例，對照組1733例）;驗證3，921例，（男性2，406例，中位生存時間3.05年;女性1，515例，中位生存時間6.93年），均為中國漢族人。采集每位患者及正常對照3-5ml外周靜脈血，-20℃儲存。
　　2.3外周血中生存相關免疫分子分析:

6、進入流式細胞分析的研究對象共278例，包括218例EC患者（現癥病人組48例，男性35例，女性13例;短期生存組45例，男性28例，女性17例;生存期5-10年組34例，男性19例，女性15例;ULS組91例，男性52例，女性39例）和60例健康對照者（男性24例，女性36例）。肝素鈉抗凝管采集每位患者及正常對照外周靜脈血10ml，無菌操作。
　　2.4組織微環(huán)境中生存相關免疫分子分析:進入免疫組織化學分析的研究對象共225例，包

7、括75例癌旁組織和150例EC組織，168例手術切除標本來自EC高發(fā)區(qū)、低發(fā)區(qū)57例，EC家族史陽性者70例、家族史陰性者155例。
　　3研究方法:
　　3.1問卷調查、隨訪及病理診斷和治療情況復核
　　通過對河南安陽、林州、鶴壁、新鄉(xiāng)等EC高發(fā)區(qū)進行EC現場流行病學調查，確定EC患者，進行入戶問卷調查和隨訪，記錄患者一般資料（年齡，性別，家族史，治療醫(yī)院等）。最終進入本研究分析的患者均經入戶調查和隨訪。隨訪截止時間

8、為2013年3月15日。
　　根據患者口述治療醫(yī)院和時間，到相應治療醫(yī)院對患者臨床病理資料(以病理診斷為準）包括患者確診時間、病理診斷、組織類型、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、治療情況（外科手術、化療、放療）;一般體格檢查（身高、體重、血壓等）進行復核，未找到原始住院記錄者，不進入最終分析。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理數據，組間比較采用卡方檢驗，Cox比例風險回歸模型進行多因素生存分析，檢驗水準取α=0.05。
　　

9、3.2 GWAS篩選生存相關SNPs
　　用德國QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取血液樣本基因組DNA，準確測定每份待標化樣本DNA的濃度，用于初篩的DNA濃度保持在50ng/μl，OD值在1.8-2.0之間，用于驗證的DNA濃度保持在15ng-20ng/μl，OD值在1.7-2.0之間。初篩選用Illumina Human610-Quad芯片，驗證選擇Sequenom iPLEX芯片。
　　計算樣本得率、SNP得率、最

10、小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)、哈迪·溫伯格(Hardy-Weinberg; HWE)平衡律。對質控后的數據用Plink1.03軟件分析并輸出結果，用Cochran-Armitage趨勢檢驗計算P值、優(yōu)勢比(Odds ratio，OR)和95％可信區(qū)間(95％ confidence interval，95％CI)。數據分析使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理，進行卡方檢驗、Kaplan-Meier生存

11、分析、Cox多因素回歸模型分析不同基因型與患者生存時間關系，檢驗標準取α=0.05。
　　3.3 FACS檢測外周血中生存相關免疫分子
　　FACS檢測278例研究對象外周血中PD-1，TIM-3，D27表達。采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測其外周血中細胞因子IL-2，IL-10，TNF-a，IFN-γ濃度。采用t檢驗、方差分析確定差異顯著性，檢驗水準取a=0.05。
　　3.4 IHC檢測腫瘤微環(huán)境中生存相關免

12、疫分子
　　應用IHC檢測組織芯片上EC癌和癌旁組織中PD-1，TIM-3，CD27表達。SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理，組間比較采用卡方檢驗，檢驗標準取α=0.05; Cox多因素回歸模型分析腫瘤微環(huán)境中PD-1，TIM-3，CD27蛋白表達與患者生存時間關系。
　　4結果:
　　4.1 ULS患者臨床病理分析
　　30，718例符合條件EC患者進入最終分析。其中ULS患者7，180例，男4，053例，平均診斷年

13、齡55±9.6，女3，127例，平均診斷年齡56±8.4;短期生存患者共23，538例，其中男15，554例，平均診斷年齡61±9.3;女7，984例，平均診斷年齡62±9.4。
　　臨床病理資料分析發(fā)現ULS者中腫瘤分期為中晚期者占91％(2，994/3，313)，中分化者占59％(1，208/2，067)， T3浸潤者占75％(1，387/1，842)、淋巴結轉移陰性者占67％(2，168/3，212)、手術治療者占80％(2

14、，955/3，705)、EC家族史陰性者占60％(2，804/4，381)、ULS者≥56歲者占72％(5，195/7，180)、男性患者占56％(4，053/7，180)。
　　對比分析發(fā)現ULS中的中晚期患者發(fā)生率低于短期生存者(91％ vs.96％，x2=69.09，P＜0.05); ULS中的高分化患者比短期生存者多兩倍(28％ vs.10％，x2=614.16，P＜0.05); T3浸潤發(fā)生率低于短期生存者(75％ vs

15、.86％，x2=16.55，P＜0.05);家族史陽性明顯高于短期生存者(40％ vs.29％，x2=68.98，P＜0.05);手術治療多于短期生存者(80％ vs.60％，x2=390.61，P＜0.05); ULS中≤45歲男性發(fā)病率是短期生存者≤45歲發(fā)病者的2倍(8.7％vs.3.5％)，女性患者約為4倍(6.7％vs.1.7％)。
　　Cox多因素生存分析顯示性別、年齡、分化程度為ULS食管癌患者預后的重要獨立影響因素

16、:女性預后明顯優(yōu)于男性(RR=1.68;95％CI:1.19-2.34);與≤45歲患者相比，≥56歲患者為生存期差危險因素(RR=0.82;95％CI:0.46-0.94);與高分化相比，中、低分化患者生存期差(HR=0.39，0.38;95％CI:0.19-0.82，0.19-0.74，)。患者腫瘤浸潤深度、有無淋巴結轉移、治療方式及家族史不是ULS患者預后獨立影響因素。
　　4.2 EC患者生存相關SNPs
　　通過初

17、篩分析篩選出的40個有價值的SNPs(p≤1X10-7)，在3，921例樣本中進行了高通量生存驗證，結果顯示其中3個SNPs是ESCC患者預后危險因素:攜帶rs1 AA、GG和GA基因型、攜帶rs2AA、GA和GG基因型及攜帶rs3 CC，CT和TT基因型的患者生存時間有差異(x2=12.258，8.399，6.671;P=0.002，0.015，0.036)。
　　校正性別、年齡、吸煙、飲酒和臨床分期等可能混雜因素后Cox多因素

18、生存分析顯示rs1、rs2、rs3變異均不是EC患者生存預后的獨立影響因素(P=0.43，0.52,0.21)。
　　分析了目標SNP和其相關區(qū)域重組和鏈鎖不平衡類型之后，3個SNPs位點分別定為于1p36.31-p36.23的CAMTA1基因、1p36.33的cyclin L2基因和11q14.1的TENM4基因上。
　　4.3外周血中免疫分子分布及與臨床病理相關分析
　　與健康對照組相比，短期生存、ULS者外周血中

19、PD-1，TIM-3高表達，CD27低表達，差異有統(tǒng)計學意義(p=3.55E-28，1.06E-37，1.57E-5)。
　　PD-1表達與性別、年齡和腫瘤分期相關(P＜0.05)，即腫瘤分期為中晚期、男性、≥56歲患者，PD-1高表達;TIM-3、CD27表達與年齡相關(P＜0.05)，即隨著年齡增長，TIM-3高表達，CD27低表達。
　　細胞因子IL-10，TNF-a，IFN-γ在不同預后EC組、健康對照組間有差異性表

20、達(p=4.44E-5，1.97E-5，0.003); IL-2表達無差異(p=0.323)。
　　4.4腫瘤微環(huán)境中免疫分子分布及與臨床病理和患者預后關系
　　TIM-3，PD-1，CD27在短期生存、ULS及對照組間有差異性表達(p=0.000，1.54E-12，0.001)。進一步兩兩比較發(fā)現TIM-3，CD27的表達在短期生存、ULS組間沒有顯著性差異(p=0.611，0.242)，PD-1的表達在SS、ULS組間有

21、顯著性差異（p=4.95E-4），SS、ULS組分別與對照組相比，其差異也有統(tǒng)計學意義(p=4.38E-14,9.75E-5)。
　　TIM-3、PD-1、CD27蛋白染色強度與EC患者的不同性別、年齡、有無家族史及高低發(fā)區(qū)無關(p＞0.05);腫瘤的浸潤深度、淋巴結有無轉移與PD-1蛋白染色強度有關，與TIM-3，CD27染色強度無關。T2與T3-4、N0與N1相比，蛋白染色強度有差異(x2=9.442，8.599; P=0.0

22、09，0.014)，與N0相比，N1期PD-1蛋白陽性、強陽性表達率增高(47％ vs35.2％，25％ vs18.3％)。
　　Kaplan-Meier生存分析顯示CD27，TIM-3表達強度對EC患者預后無影響(x2=1.283，0.112; P=0.52，0.945)。PD-1陰性表達者生存期好于PD-1陽性表達者(x2=14.155，P=0.001); COX多因素生存分析顯示CD27，TIM-3，PD-1表達強度不是EC

23、患者預后獨立影響因素(P=0.172，0.275，0.049)。
　　5結論:
　　5.1 ULS者以中晚期、中分化、低淋巴結轉移率、T3、手術治療、≥56歲、男性患者高發(fā)病率為主;Cox多因素生存分析顯示年齡、性別、分化程度是超長期EC患者預后的重要獨立影響因素。
　　5.2 rs1、rs2、rs3遺傳變異是影響EC患者生存的危險因素，分別定為于1p36.31-p36.23的CAMTA1基因、1p36.33的cycl